Fe2O3包埋肌红蛋白的直接电化学及生物传感器应用
Fe2O3包埋肌红蛋白的直接电化学及生物传感器应用[20200412223200]
摘 要
本实验研究了修饰在石墨电极（GE）上的肌红蛋白（Mb）的循环伏安法和电催化性能。石墨电极表面的肌红蛋白在0.1M的PBS（pH=7.0）溶液中有一对对称的氧化还原峰，说明肌红蛋白与石墨电极之间存在直接电子转移，其电子转移常数为3.977s-1，式量电位为–0.307V（vs·SCE）。表面覆盖量为г = 3.733×10-10mol/cm2。纳米三氧化二铁（Fe2O3）和二甲亚砜能加速电极与肌红蛋白之间的直接电子转移。能谱分析表明，固定在Mb/Fe2O3 /DMSO膜中的Mb能保持其生物活性，电化学阻抗谱进一步表征了电极的表面性质。经温度测定这一修饰电极表现出高耐热性可达75 oC，并且在没有电子媒介体存在的情况下对双氧水和苯酚催化效果良好。催化电流值大小与双氧水浓度呈线性关系，线性范围为0.01至0.85μM，检测限在9.423×10-3mM，表观米氏常数为0.23mM ，灵敏度为137.9mA/M·cm-2，呈现出高亲和性。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:生物传感器肌红蛋白双氧水三氧化二铁直接电子转移
目 录
1. 前言 1
2. 实验部分 4
2.1 材料与试剂 4
2.1.1 实验主要仪器 4
2.1.2 实验主要药品 4
2.2 电极制备 5
2.2.1 打磨电极 5
2.2.2 配制溶液 5
2.2.3 制备六种电极 5
2.3 测试方法 6
3. 结果与讨论 6
3.1 Mb/Fe2O3/DMSO膜的光谱分析 6
3.2 Mb/Fe2O3/DMSO/GE修饰电极的直接电化学行为 8
3.3溶液pH值对Mb/Fe2O3/DMSO/GE直接电子传递的影响 12
3.4 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极的交流阻抗性质的研究 13
3.5 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极对苯酚的催化 15
3.6 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极对H2O2的催化 15
3.7 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极的热力学稳定性 17
3.8 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极的重复性 18
4. 结论 20
参考文献 21
致谢 22
1. 前言
建立在化学化工、生物、物理、医学、计算机技术等基础之上的生物传感技术，为食品安全、环境监测、精细化工、材料科学等产业的发展提供了空前的动力，因此自生物传感技术问世以来，便受到了人们极大的关注，由此也导致生物传感技术成为自20世纪后半期国际上突飞猛进的技术领域之一。
得益于人们对光谱分析、电子技术、精细化学等研究领域进行的不懈探索和取得的重大成果，用于物质检测的各种分析手段正日益丰富和不断发展。在新一代分析工具中，生物传感器凭借其特有的优势，在分析化学中扮演着不可替代的作用，其巨大的应用潜力也激厉着科研工作者们不断进行着新的探索。生物传感器[]是一门发展迅速的高新技术，它由生物、化学、计算机科学、物理相互交叉发展，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测等优点；生物传感器能够实现高度自动化，并且体积较小，集成度高，因此对工作环境要求较低，便于操作，在精细化学、环境保护、粮食安全、医学等很多领域都有着巨大的应用价值[]，引进了世界各国的极大关注。
相较于传统分析手段，生物传感技术优势显著：由选择性好的生物材料作为分子识别元件组成，生物传感器在检测前并不需要样品预处理，能够快速检测，并且可实现真正的“无试剂分析”；生物传感器一般体积较小，可以实现连续监测、在线监测，除此之外，生物传感器还具有响应快、样品用量少、可反复多次使用、低成本的优点[]。当然，生物传感器也存在工作条件要求苛刻、长期工作稳定性不足、批量生产困难等缺点。因此，研究如何在保持生物传感器优点的同时尽可能提高其长期工作稳定性和工作环境适用性是生物传感器研究者工作中的重点。而现代微生物学、物理学、新型材料（含纳米材料）科学、生物学、医学及现代化学的交叉和发展，已促使生物传感器成为当代研究最为活泼的领域之一。 生物传感器发展至今，种类繁多，其中酶电极的研究最为成熟。酶电极，顾名思义，就是将酶固定在各类电极表面，利用酶分子良好的生物选择性和催化活性，再结合电极响应迅速的优势，就能实现对某种物质的快速定性鉴定和对特定化合物浓度快速、便捷的定量检测。酶分子是一种具有生物催化功能的特殊蛋白质，与化学催化剂相比具有很多优点，如反应速度快，灵敏度高。酶传感器这一概念是由美国的C.Clark Jnr教授最先描述的，之后由Clark本人和Lyons用实验阐述，他们将葡萄糖氧化酶用透析膜固定在电极表面，通过输出的电流值从而检测出溶液中的葡萄糖含量，这标志着以Clark的酶电极为代表的第一代经典电化学生物传感器问世。之后，人们利用介体将生物成分共价结合在电极表面，制成第二代介体酶传感器，用以减少物质干扰和解决氧依赖问题。此后，随着分析检测的微量化要求和快速性要求越来越高，新的生物传感器要求具备更好的选择性、更高的灵敏度和更快的响应速度，因此人们将目光重新转向了非介体酶电极，进行直接酶电极的研究，由此形成了第三代生物传感器的发展。
直接酶电极既不需要氧参与作用，也不需要化学介体来加速电子交流，通常情况下也不要求固定化载体，而是将酶的氧化还原中心裸露在电极表面，直接进行酶与电极的快速电子转移，而事实上，由于大多数蛋白质分子较大，其氧化还原活性中心被包埋在分子中心，难以裸露在电极表面，因此和电极表面相距较远，并且蛋白质吸附在电极表面以后，分子易于变性失活，导致酶与电极之间的直接电子交流受影响，转移速率较慢。这就要求人们采取某些手段使得直接电化学生物传感技术得到改善，而纳米材料的引入则有助于解决这个问题。
纳米材料[]具有完全不同于普通材料的结构与性能，是全世界最受关注并且研究最广泛的科学领域之一。纳米尺寸范围内的材料，具有界面效应和表面效应[]等特有的纳米效应。粒子的尺寸减小会引起其比表面积和表面结合能相应增大[]。纳米材料具有高化学活性[]，这是由于它尺寸小，比表面积大，易于和其它原子相结合。纳米生物传感器[]，顾名思义，就是将纳米技术引入生物传感器，使其成为灵敏度更高，实用性更大的新型生物传感器，对纳米生物传感器的研究，涉及到电子科技、精细化工、生物技术、纳米科技等多项领域，综合运用各类先进技术以达到快速、精确检测的生物传感技术，由于其在分析化学领域无可比拟的巨大优势而日益受到科研工作者的关注，成为国际研究前沿与热点。用于固定生物材料的纳米材料有纳米硫化镉[]、二氧化硅纳米粒子[]、二氧化锡、纳米金[]、锰纳米粒子[]等。陈钰等[]通过纳米金颗粒将生物材料固定在电极表面，发现与生物材料直接修饰电极相比较，纳米金颗粒材料的加入有助于保持生物材料的活性，而且纳米材料的存在能够构建一个新的界面，使生物材料与电极的距离靠近，便于电子交流，此外，用纳米材料固定后，修饰膜更加稳定，不易脱落，可增加重复利用率。安玲玲等[]在三维有序石墨烯与二氧化钛上修饰过氧化氢酶，发现在多孔纳米TiO2 材料中掺杂石墨烯可以提高修饰电极的导电性，有利于酶在电极上的直接电子传递过程。本实验中采用纳米三氧化二铁（Fe2O3）用于肌红蛋白在电极表面的固定，借此提高其耐高温性和加快电子转移速率。纳米三氧化二铁与普通三氧化二铁相比，具有更大的比表面积，可用于催化、储能、分子吸附、离子交换等，同时价格低廉，易于获得，因此较多用来作为酶蛋白在电极表面的固定化载体。
肌红蛋白（myoglobin，Mb）是一种水溶性蛋白，相对分子质量约为17000，含有一个亚铁血红素基团，亚铁血红素或称血红素，由原卟啉环和中心铁原子组成。原卟啉环含4个吡咯环，彼此通过亚甲基连接，附有4个甲基、2个乙烯基和2个丙酸酯侧链[]，又称铁－原卟啉。原卟啉环中间的铁为2价或3价，使亚红素分子呈现氧化还原两态，这种性质是促使肌红蛋白成为优质的生物传感材料的主要原因。
吕亚芬等[]在一项研究中，将肌红蛋白修饰在碳纳米管上，研究碳纳米管对肌红蛋白直接电子转移的促进作用，循环伏安法测定结果表明，在一定范围内，式量电位不随扫速的变化而变化，式量电位随pH的变化表明电子转移过程伴随着H+转移过程。进一步实验表明，固定在碳纳米管表面的肌红蛋白能保持其生物活性并对双氧水具有电催化性。荣联清[]等用魔芋多糖（KGM）混和N，N－二甲基甲酰胺（DMF）固定肌红蛋白，制备了稳定的修饰电极，并研究了该修饰电极的直接电化学和电催化性能。实验表明，峰电流随扫速的增大正比增大，呈现出典型的表面控制行为。同时，修饰电极对双氧水催化作用明显，测定出的米氏常数为80.8 μmol/L。除了肌红蛋白之外，其它的酶和蛋白质的直接电化学和催化活动，像过氧化氢酶[]，细胞色素C[]，辣根过氧化物酶[]等修饰电极也都被大量研究。
摘 要
本实验研究了修饰在石墨电极（GE）上的肌红蛋白（Mb）的循环伏安法和电催化性能。石墨电极表面的肌红蛋白在0.1M的PBS（pH=7.0）溶液中有一对对称的氧化还原峰，说明肌红蛋白与石墨电极之间存在直接电子转移，其电子转移常数为3.977s-1，式量电位为–0.307V（vs·SCE）。表面覆盖量为г = 3.733×10-10mol/cm2。纳米三氧化二铁（Fe2O3）和二甲亚砜能加速电极与肌红蛋白之间的直接电子转移。能谱分析表明，固定在Mb/Fe2O3 /DMSO膜中的Mb能保持其生物活性，电化学阻抗谱进一步表征了电极的表面性质。经温度测定这一修饰电极表现出高耐热性可达75 oC，并且在没有电子媒介体存在的情况下对双氧水和苯酚催化效果良好。催化电流值大小与双氧水浓度呈线性关系，线性范围为0.01至0.85μM，检测限在9.423×10-3mM，表观米氏常数为0.23mM ，灵敏度为137.9mA/M·cm-2，呈现出高亲和性。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:生物传感器肌红蛋白双氧水三氧化二铁直接电子转移
目 录
1. 前言 1
2. 实验部分 4
2.1 材料与试剂 4
2.1.1 实验主要仪器 4
2.1.2 实验主要药品 4
2.2 电极制备 5
2.2.1 打磨电极 5
2.2.2 配制溶液 5
2.2.3 制备六种电极 5
2.3 测试方法 6
3. 结果与讨论 6
3.1 Mb/Fe2O3/DMSO膜的光谱分析 6
3.2 Mb/Fe2O3/DMSO/GE修饰电极的直接电化学行为 8
3.3溶液pH值对Mb/Fe2O3/DMSO/GE直接电子传递的影响 12
3.4 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极的交流阻抗性质的研究 13
3.5 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极对苯酚的催化 15
3.6 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极对H2O2的催化 15
3.7 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极的热力学稳定性 17
3.8 Mb/Fe2O3/DMSO/GE电极的重复性 18
4. 结论 20
参考文献 21
致谢 22
1. 前言
建立在化学化工、生物、物理、医学、计算机技术等基础之上的生物传感技术，为食品安全、环境监测、精细化工、材料科学等产业的发展提供了空前的动力，因此自生物传感技术问世以来，便受到了人们极大的关注，由此也导致生物传感技术成为自20世纪后半期国际上突飞猛进的技术领域之一。
得益于人们对光谱分析、电子技术、精细化学等研究领域进行的不懈探索和取得的重大成果，用于物质检测的各种分析手段正日益丰富和不断发展。在新一代分析工具中，生物传感器凭借其特有的优势，在分析化学中扮演着不可替代的作用，其巨大的应用潜力也激厉着科研工作者们不断进行着新的探索。生物传感器[]是一门发展迅速的高新技术，它由生物、化学、计算机科学、物理相互交叉发展，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测等优点；生物传感器能够实现高度自动化，并且体积较小，集成度高，因此对工作环境要求较低，便于操作，在精细化学、环境保护、粮食安全、医学等很多领域都有着巨大的应用价值[]，引进了世界各国的极大关注。
相较于传统分析手段，生物传感技术优势显著：由选择性好的生物材料作为分子识别元件组成，生物传感器在检测前并不需要样品预处理，能够快速检测，并且可实现真正的“无试剂分析”；生物传感器一般体积较小，可以实现连续监测、在线监测，除此之外，生物传感器还具有响应快、样品用量少、可反复多次使用、低成本的优点[]。当然，生物传感器也存在工作条件要求苛刻、长期工作稳定性不足、批量生产困难等缺点。因此，研究如何在保持生物传感器优点的同时尽可能提高其长期工作稳定性和工作环境适用性是生物传感器研究者工作中的重点。而现代微生物学、物理学、新型材料（含纳米材料）科学、生物学、医学及现代化学的交叉和发展，已促使生物传感器成为当代研究最为活泼的领域之一。 生物传感器发展至今，种类繁多，其中酶电极的研究最为成熟。酶电极，顾名思义，就是将酶固定在各类电极表面，利用酶分子良好的生物选择性和催化活性，再结合电极响应迅速的优势，就能实现对某种物质的快速定性鉴定和对特定化合物浓度快速、便捷的定量检测。酶分子是一种具有生物催化功能的特殊蛋白质，与化学催化剂相比具有很多优点，如反应速度快，灵敏度高。酶传感器这一概念是由美国的C.Clark Jnr教授最先描述的，之后由Clark本人和Lyons用实验阐述，他们将葡萄糖氧化酶用透析膜固定在电极表面，通过输出的电流值从而检测出溶液中的葡萄糖含量，这标志着以Clark的酶电极为代表的第一代经典电化学生物传感器问世。之后，人们利用介体将生物成分共价结合在电极表面，制成第二代介体酶传感器，用以减少物质干扰和解决氧依赖问题。此后，随着分析检测的微量化要求和快速性要求越来越高，新的生物传感器要求具备更好的选择性、更高的灵敏度和更快的响应速度，因此人们将目光重新转向了非介体酶电极，进行直接酶电极的研究，由此形成了第三代生物传感器的发展。
直接酶电极既不需要氧参与作用，也不需要化学介体来加速电子交流，通常情况下也不要求固定化载体，而是将酶的氧化还原中心裸露在电极表面，直接进行酶与电极的快速电子转移，而事实上，由于大多数蛋白质分子较大，其氧化还原活性中心被包埋在分子中心，难以裸露在电极表面，因此和电极表面相距较远，并且蛋白质吸附在电极表面以后，分子易于变性失活，导致酶与电极之间的直接电子交流受影响，转移速率较慢。这就要求人们采取某些手段使得直接电化学生物传感技术得到改善，而纳米材料的引入则有助于解决这个问题。
纳米材料[]具有完全不同于普通材料的结构与性能，是全世界最受关注并且研究最广泛的科学领域之一。纳米尺寸范围内的材料，具有界面效应和表面效应[]等特有的纳米效应。粒子的尺寸减小会引起其比表面积和表面结合能相应增大[]。纳米材料具有高化学活性[]，这是由于它尺寸小，比表面积大，易于和其它原子相结合。纳米生物传感器[]，顾名思义，就是将纳米技术引入生物传感器，使其成为灵敏度更高，实用性更大的新型生物传感器，对纳米生物传感器的研究，涉及到电子科技、精细化工、生物技术、纳米科技等多项领域，综合运用各类先进技术以达到快速、精确检测的生物传感技术，由于其在分析化学领域无可比拟的巨大优势而日益受到科研工作者的关注，成为国际研究前沿与热点。用于固定生物材料的纳米材料有纳米硫化镉[]、二氧化硅纳米粒子[]、二氧化锡、纳米金[]、锰纳米粒子[]等。陈钰等[]通过纳米金颗粒将生物材料固定在电极表面，发现与生物材料直接修饰电极相比较，纳米金颗粒材料的加入有助于保持生物材料的活性，而且纳米材料的存在能够构建一个新的界面，使生物材料与电极的距离靠近，便于电子交流，此外，用纳米材料固定后，修饰膜更加稳定，不易脱落，可增加重复利用率。安玲玲等[]在三维有序石墨烯与二氧化钛上修饰过氧化氢酶，发现在多孔纳米TiO2 材料中掺杂石墨烯可以提高修饰电极的导电性，有利于酶在电极上的直接电子传递过程。本实验中采用纳米三氧化二铁（Fe2O3）用于肌红蛋白在电极表面的固定，借此提高其耐高温性和加快电子转移速率。纳米三氧化二铁与普通三氧化二铁相比，具有更大的比表面积，可用于催化、储能、分子吸附、离子交换等，同时价格低廉，易于获得，因此较多用来作为酶蛋白在电极表面的固定化载体。
肌红蛋白（myoglobin，Mb）是一种水溶性蛋白，相对分子质量约为17000，含有一个亚铁血红素基团，亚铁血红素或称血红素，由原卟啉环和中心铁原子组成。原卟啉环含4个吡咯环，彼此通过亚甲基连接，附有4个甲基、2个乙烯基和2个丙酸酯侧链[]，又称铁－原卟啉。原卟啉环中间的铁为2价或3价，使亚红素分子呈现氧化还原两态，这种性质是促使肌红蛋白成为优质的生物传感材料的主要原因。
吕亚芬等[]在一项研究中，将肌红蛋白修饰在碳纳米管上，研究碳纳米管对肌红蛋白直接电子转移的促进作用，循环伏安法测定结果表明，在一定范围内，式量电位不随扫速的变化而变化，式量电位随pH的变化表明电子转移过程伴随着H+转移过程。进一步实验表明，固定在碳纳米管表面的肌红蛋白能保持其生物活性并对双氧水具有电催化性。荣联清[]等用魔芋多糖（KGM）混和N，N－二甲基甲酰胺（DMF）固定肌红蛋白，制备了稳定的修饰电极，并研究了该修饰电极的直接电化学和电催化性能。实验表明，峰电流随扫速的增大正比增大，呈现出典型的表面控制行为。同时，修饰电极对双氧水催化作用明显，测定出的米氏常数为80.8 μmol/L。除了肌红蛋白之外，其它的酶和蛋白质的直接电化学和催化活动，像过氧化氢酶[]，细胞色素C[]，辣根过氧化物酶[]等修饰电极也都被大量研究。
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