柱前衍生化1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的改良反相高效液相色谱法测定杜氏盐藻多糖的单糖组成
柱前衍生化1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的改良反相高效液相色谱法测定杜氏盐藻多糖的单糖组成[20200907165322]
摘要:建立的柱前衍生化I.-苯基-III-甲基-V-吡唑啉酮(PMP)的改良高效液相色谱法可以迅速.灵敏的测定X种单糖组分,这种方法常用于海藻多糖的测定.本文筛选出适合PMP衍生物分离的色谱柱为EclipseXDB-CI.VIII,以0.I.mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相,考察了pH值和乙腈体积分数对各种糖的PMP衍生物的保留值及分离的影响.文章对多糖衍生化过程的水解条件进行了优化,并用于测定杜氏盐藻中的V种单糖成分.结果表明,PDI.和PDIVa为酸性杂多糖,主要含葡萄糖和半乳糖,PDIVa含有硫酸化基团;PDII和PDIII均为葡聚糖;而PDIVb是以共价键形式与核酸相连的多糖复合物.
关键字:杜氏盐藻,多糖,单糖组成,高效液相色谱法,柱前衍生-I.-苯基-III-甲基-V-吡唑啉酮
I.介绍
杜氏盐藻(杜氏盐藻)是绿藻中I.种能在盐水环境中生活的没有细胞壁的独特单细胞物种,因为含有丰富类胡萝卜素(主要是β-胡萝卜素),其在保健和营养产品中广泛应用(Borowitzka,Borowitzka,&Moulton,I.IXVIIIIV;Murthyetal.,II00V).同时,其提取后的藻渣中存在含量丰富的多糖类物质,含量占杜氏盐藻的I.II-IV0％(Brown,I.IXIXI.),(Fabregas,Garcia,&Fernandez-Alonso,I.IXIXIX;孙,王,薛,和王,I.IXIXVII;郑,王,石,楚,II00IV)也已经研究了多糖类物质具有抗肿瘤,抗病毒和免疫调节特性等生物活性. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
然而,对杜氏盐藻中多糖的单糖组成研究却很少报道.郑,王,张,沉(I.IXIXVII)首次报道了I.种从盐藻渣中提取的多糖,纸层析后确定其单糖组成为葡萄糖,半乳糖,木糖,甘露糖,鼠李糖.后来,薛,尹,王,徐(II00III);谢,印,陈,谢,王(II00V)用热水浸提法从杜氏盐藻中提取了III种多糖成分并用DEAE-IIIII离子交换柱.SephadexG-I.00凝胶过滤柱进行分离纯化.这III个成分通过GC,IR和钡硫酸比浊法确定是葡聚糖,硫酸蛋白多糖和主要含有葡萄糖的硫酸杂多糖.在本研究中,建立了反相高效液相色谱法通过UV检测器和ZORBAXEclipseXDB-CI.VIII柱同时测定I.II种PMP标记的糖,并对衍生化反应的时间和反应体系的中和条件进行优化.同时,将优化的方法成功应用于杜氏盐藻多糖的成分分析.
II实验
II.I.化学品和试剂
单糖(葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,鼠李糖,岩藻糖,核糖,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)标准品以及I.-苯基-III-甲基-V-吡唑啉酮(PMP)(Sigma–AldrichCo,美国),葡萄糖胺和半乳糖胺(AcrosOrganicsCo.,美国),HPLC级乙腈(TediaCo.,美国),整个实验中使用的水是通过aMilli-Q系统双蒸和纯化所得(美国Millipore,美国).其他所有使用的化学品和溶剂均为分析纯或HPLC级,除非另有规定.杜氏盐藻多糖用内蒙古兰太生物工程公司提供的杜氏盐藻粉提取和纯化制得.
II.II提取,纯化及盐藻多糖的相对分子质量分析
用丙酮萃取类胡萝卜素后,萃取残留物与低分子量等极性有机化合物通过用乙醇回流除去.然后将有机溶剂蒸发,残余物在真空状态下进行干燥.将预处理后的干粉与碱性水(pH值由II.0M的NaOH调至IX.0)不断搅拌在VIII0?℃下水浴III.V小时提取两次.冷却后,将混合物用II.0MHCl调节pH值至VII.0,然后离心(IV000r/min,II0分钟),取上清液将PH值调节至IV.0用于沉淀蛋白并离心.将所得上清液pH再次调整至VII.0,浓缩并用III倍体积的乙醇与之混合.在IV℃下静置I.II小时后,离心,将沉淀物重新水化.通过Sevag法(王等人,II00VII)将自由蛋白除去:将多糖溶液和Sevag试剂(氯仿:正丁醇=IV:I.,V/V)混合(多糖溶液:Sevag试剂=V:I.,v/v)并振荡III0分钟,然后离心除去变性蛋白质,将上述过程重复V-VI次.最后,将多糖用蒸馏水透析(分子量最大IIIV00Da),然后浓缩,并冷冻干燥,获得粗多糖提取物(PD).
用水溶解PD,浓度为I.0mg/ml,通过阴离子交换色谱法分级通过DEAE-SepharoseFastFlow柱(直径III.V厘米×III0厘米),洗脱液为含有NaCl(浓度为0.0I.-I..0M)的0.0IIM的Tris-HCl缓冲液,流速为VIII.0ml/min进行线性梯度洗脱.然后将IV馏份(PDI.,PDII,PDIII和PDIV)收集在I.个馏分收集器中并浓缩,透析III天并冻干.再将PDIV加载到CL-VIB琼脂糖凝胶过滤柱(直径II.VI厘米×I.00厘米)上,并用0.I.MNaCl以0.Vml/min的流速洗脱,获得的洗脱液(PDIVa和PDIVb)合并.浓缩.透析和冻干.洗脱级分利用苯酚-硫酸法检测碳水化合物(Dubo *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
is,Gilles,Hamilton,Rebers,&Smith,I.IXVVI).
多糖组分的相对分子质量分析根据孙,唐,顾和李(II00V)所描述的HPSEC程序进行计算.
II.III多糖的水解
吸取I.00ul的多糖样品溶液(III-IVmg/ml)于小安瓿瓶中,加入I.00μl的IVmol/LTFA(III氟乙酸),充NII封管,I.I.0℃烘箱中水解IIh;冷却后,加II00ul甲醇溶液后充入氮气流并水浴加热至蒸干,重复III次,除去TFA.将干燥的多糖样品溶解在I.00ul水中用于后续衍生化.
II.IV多糖样品与单糖标准品的衍生
取I.00ul多糖样品水解溶液(单糖标准混合物)加入I.00ul0.VIM氢氧化钠溶液混合,取V0ul混合物在有盖的小样品管中,加入V0ul0.Vmol/LPMP甲醇溶液,并通过涡旋混合器充分混合;将混合物在VII0℃.水浴I.00分钟后,冷却至室温,加入V0ul的0.IIIM盐酸,蒸发溶液至干,加水至I.mL,再加等体积的氯仿,振摇,静置,弃去有机相,如此萃取III次.将水相通过0.IVVum微孔膜过滤后供HPLC进样分析.水解的样品和标准样品的衍生过程必须在相同的条件下同时进行.
III盐藻多糖组分的单糖组成分析
AgilentI.I.00(美国)高效液相色谱仪,包括GI.IIII.I.AIV元泵,GI.IIII.VBDAD检测器,GI.IIII.IIIAII0ul循环自动进样器,GI.IIIVIIIXA在线脱气机,GI.IIII.VBII极管阵列检测器,AgilentI.I.00(美国Agilent公司)化学工作站系统收集的数据;I.个特殊的ZORBAXEclipseXDB-CI.VIIIHPLC柱(IV.VI×IIV0mm,Vum)(美国Agilent公司);室温III0℃;流动相为0.I.M.pHVI.VII的磷酸盐缓冲液-乙腈(VIIIIII:I.VII(v/v,％)),流速为I.ml/min,紫外吸收检测波长:IIIVVnm.PMP的衍生物通过比较峰面积的积分值校准的标准曲线定量分析.
IV结果与讨论
IV.I.单糖PMP衍生物分离的优化
单糖的PMP衍生物的分离,研究了利用各种固定和流动相.通过对固定相为VIII种中性,II种酸性和II种氨基用PMP标记的糖进行快速和有效的分离,最合适的柱子为ZORBAXEclipseXDB-CI.VIII柱,将其与WatersAtlantis-DCI.VIII(Waters,美国),WatersSymmetryCI.VIII(Waters,美国),ZORBAXExtend-CI.VIII(Agilent,美国),HypersilAA-ODS(SMI-LabHutLtd.,英国)和VenusilXBP-CI.VIII(AgelaTechnologiesInc.,美国)相比,ZORBAXEclipseXDB-CI.VIII柱子的分离结果显示为图I..
图I.为单糖标准样品(a)和杜氏盐藻多糖级分PDI.水解样品(b)的PMP衍生化产物的色谱图
对PMP衍生物的保留行为的检查,通过改变0.I.M磷酸盐缓冲液混合物的pH值和用不同比例的乙腈作为流动相进行了研究.不同乙腈的比例对上述PMP标记的VIII种中性糖和两个酸性糖分离的滞留时间的影响结果如图II(a)(缓冲液pHVI.0)所示.结果表明,随着乙腈比例的增加,I.0种糖的PMP衍生物的洗脱过程变得更快,但衍生物的洗脱顺序保持不变,乙腈的比例为I.VII％(V/V)时有较好的分离效果.因为PMP-糖与碱性组充电状态的影响,pH值也对滞留时间和PMP-糖分离效果有明显影响.以乙腈的比例为I.VII％,改变磷酸盐缓冲液pH值对保留时间的影响进行了考察,如图II(b)所示.结果表明:增加了磷酸盐缓冲液pH可以快速洗脱而且衍生物的洗脱顺序保持不变.pH值为VI.VII时洗脱及分离效果较好.此外,当用甲醇作有机溶剂的流动相时,单糖衍生物的分离效果明显差于乙腈.结果显示,VIII种中性.II种酸性糖的PMP衍生物在0.I.M.pHVI.VII的磷酸盐缓冲液和体积分数为I.VII％(体积/体积)的乙腈作为流动相是最佳分离条件.如图I.所示II种氨基糖未在盐藻多糖样品中检测到,所以这两个糖在不同流动相中的保留行为不做研究.
图II是流动相乙腈的百分含量比例(a)和磷酸盐缓冲液pH值(b)对I.0种单糖的PMP衍生物的保留时间的影响
IV.IIPMP衍生化反应的优化
根据文献,PMP衍生化反应时间通常选定为III0分钟(Hondaetal.,I.IXVIIIIX;Strydom,I.IXIXIV)或II小时(Fu&ONeill,I.IXIXV).衍生化反应时间对衍生物峰面积的影响结果如图III所示:图中的数据是III次重复测定的平均值,相对标准偏差为II.I.-IV.VIII％.结果表明每种糖的衍生物的峰面积在不同的衍生反应时间下是不I.样的.反应时间为I.00分钟时,每种糖的衍生物的峰面积显示最大,这比在III0分钟时的峰面积至少大III0%左右,故衍生化反应时间选为I.00分钟.
由于过量的PMP用于衍生化反应,因此,HPLC分析之前,必须用氯仿萃取除去剩余的试剂.PMP中的碱性基团在强酸溶液中,几乎完全被氯仿萃取,由于PMP的质子化作用,在高pH溶液中大部分的PMP-糖也被萃取(Strydom,I.IXIXIV).因为单糖的定量回收对于准确的单糖组成分析是至关重要的,所以提取前的PMP衍生物溶液的pH值是I.个重要的参数;Honda(I.IXVIIIIX)等人用等摩尔的盐酸中和反应溶液中的氢氧化钠.Strydom(I.IXIXIV)和付(I.IXIXV)等人选择用过量的盐酸(pHIII-V)中和溶液.在本文中选择不同体积的HCl(0.IIIM)用于中和溶液,研究PMP衍生物峰面积的变化.结果表明PMP衍生物的峰面积随盐酸量的增加而减少,也许是因为衍生品在酸性溶液中不稳定.当使用V0ul的HCl(等摩尔盐酸)用于中和,除了葡萄糖外大部分的PMP衍生物表现出极大的峰面积和最高检测灵敏度.
图III为衍生反应时间对单糖的PMP衍生物的峰面积的影响
V结论
本文对PMP柱前衍生RP-HPLC法测定多糖的单糖组成的分析条件进行了详细地研究和优化.改进的柱前衍生高效液相色谱法是适用于多糖样品中高分辨率的微量成分的分离且同时进行多种糖类成分分析.盐藻多糖的单糖组成分析是由改进之后的方法来确定的.结果表明,PDI.和PDIVa是分别主要含葡萄糖和半乳糖的酸性杂多糖,并且PDIVa含有硫酸基;PDII和PDIII均为葡聚糖;而PDIVb是以共价键连接核酸的多糖复合物.PDIVa(MW=IVIIIV.IIkDa的)的组成推论是由Fabregas(I.IXIXIX)等证实的:从杜氏盐藻中提取的具有抗病毒活性成分的水提物含有百万级分子量的硫酸多糖,而像PDIVb这种与核酸相连的多糖结构,至今很少报道.
摘要:建立的柱前衍生化I.-苯基-III-甲基-V-吡唑啉酮(PMP)的改良高效液相色谱法可以迅速.灵敏的测定X种单糖组分,这种方法常用于海藻多糖的测定.本文筛选出适合PMP衍生物分离的色谱柱为EclipseXDB-CI.VIII,以0.I.mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相,考察了pH值和乙腈体积分数对各种糖的PMP衍生物的保留值及分离的影响.文章对多糖衍生化过程的水解条件进行了优化,并用于测定杜氏盐藻中的V种单糖成分.结果表明,PDI.和PDIVa为酸性杂多糖,主要含葡萄糖和半乳糖,PDIVa含有硫酸化基团;PDII和PDIII均为葡聚糖;而PDIVb是以共价键形式与核酸相连的多糖复合物.
关键字:杜氏盐藻,多糖,单糖组成,高效液相色谱法,柱前衍生-I.-苯基-III-甲基-V-吡唑啉酮
I.介绍
杜氏盐藻(杜氏盐藻)是绿藻中I.种能在盐水环境中生活的没有细胞壁的独特单细胞物种,因为含有丰富类胡萝卜素(主要是β-胡萝卜素),其在保健和营养产品中广泛应用(Borowitzka,Borowitzka,&Moulton,I.IXVIIIIV;Murthyetal.,II00V).同时,其提取后的藻渣中存在含量丰富的多糖类物质,含量占杜氏盐藻的I.II-IV0％(Brown,I.IXIXI.),(Fabregas,Garcia,&Fernandez-Alonso,I.IXIXIX;孙,王,薛,和王,I.IXIXVII;郑,王,石,楚,II00IV)也已经研究了多糖类物质具有抗肿瘤,抗病毒和免疫调节特性等生物活性. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
然而,对杜氏盐藻中多糖的单糖组成研究却很少报道.郑,王,张,沉(I.IXIXVII)首次报道了I.种从盐藻渣中提取的多糖,纸层析后确定其单糖组成为葡萄糖,半乳糖,木糖,甘露糖,鼠李糖.后来,薛,尹,王,徐(II00III);谢,印,陈,谢,王(II00V)用热水浸提法从杜氏盐藻中提取了III种多糖成分并用DEAE-IIIII离子交换柱.SephadexG-I.00凝胶过滤柱进行分离纯化.这III个成分通过GC,IR和钡硫酸比浊法确定是葡聚糖,硫酸蛋白多糖和主要含有葡萄糖的硫酸杂多糖.在本研究中,建立了反相高效液相色谱法通过UV检测器和ZORBAXEclipseXDB-CI.VIII柱同时测定I.II种PMP标记的糖,并对衍生化反应的时间和反应体系的中和条件进行优化.同时,将优化的方法成功应用于杜氏盐藻多糖的成分分析.
II实验
II.I.化学品和试剂
单糖(葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,鼠李糖,岩藻糖,核糖,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)标准品以及I.-苯基-III-甲基-V-吡唑啉酮(PMP)(Sigma–AldrichCo,美国),葡萄糖胺和半乳糖胺(AcrosOrganicsCo.,美国),HPLC级乙腈(TediaCo.,美国),整个实验中使用的水是通过aMilli-Q系统双蒸和纯化所得(美国Millipore,美国).其他所有使用的化学品和溶剂均为分析纯或HPLC级,除非另有规定.杜氏盐藻多糖用内蒙古兰太生物工程公司提供的杜氏盐藻粉提取和纯化制得.
II.II提取,纯化及盐藻多糖的相对分子质量分析
用丙酮萃取类胡萝卜素后,萃取残留物与低分子量等极性有机化合物通过用乙醇回流除去.然后将有机溶剂蒸发,残余物在真空状态下进行干燥.将预处理后的干粉与碱性水(pH值由II.0M的NaOH调至IX.0)不断搅拌在VIII0?℃下水浴III.V小时提取两次.冷却后,将混合物用II.0MHCl调节pH值至VII.0,然后离心(IV000r/min,II0分钟),取上清液将PH值调节至IV.0用于沉淀蛋白并离心.将所得上清液pH再次调整至VII.0,浓缩并用III倍体积的乙醇与之混合.在IV℃下静置I.II小时后,离心,将沉淀物重新水化.通过Sevag法(王等人,II00VII)将自由蛋白除去:将多糖溶液和Sevag试剂(氯仿:正丁醇=IV:I.,V/V)混合(多糖溶液:Sevag试剂=V:I.,v/v)并振荡III0分钟,然后离心除去变性蛋白质,将上述过程重复V-VI次.最后,将多糖用蒸馏水透析(分子量最大IIIV00Da),然后浓缩,并冷冻干燥,获得粗多糖提取物(PD).
用水溶解PD,浓度为I.0mg/ml,通过阴离子交换色谱法分级通过DEAE-SepharoseFastFlow柱(直径III.V厘米×III0厘米),洗脱液为含有NaCl(浓度为0.0I.-I..0M)的0.0IIM的Tris-HCl缓冲液,流速为VIII.0ml/min进行线性梯度洗脱.然后将IV馏份(PDI.,PDII,PDIII和PDIV)收集在I.个馏分收集器中并浓缩,透析III天并冻干.再将PDIV加载到CL-VIB琼脂糖凝胶过滤柱(直径II.VI厘米×I.00厘米)上,并用0.I.MNaCl以0.Vml/min的流速洗脱,获得的洗脱液(PDIVa和PDIVb)合并.浓缩.透析和冻干.洗脱级分利用苯酚-硫酸法检测碳水化合物(Dubo *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
is,Gilles,Hamilton,Rebers,&Smith,I.IXVVI).
多糖组分的相对分子质量分析根据孙,唐,顾和李(II00V)所描述的HPSEC程序进行计算.
II.III多糖的水解
吸取I.00ul的多糖样品溶液(III-IVmg/ml)于小安瓿瓶中,加入I.00μl的IVmol/LTFA(III氟乙酸),充NII封管,I.I.0℃烘箱中水解IIh;冷却后,加II00ul甲醇溶液后充入氮气流并水浴加热至蒸干,重复III次,除去TFA.将干燥的多糖样品溶解在I.00ul水中用于后续衍生化.
II.IV多糖样品与单糖标准品的衍生
取I.00ul多糖样品水解溶液(单糖标准混合物)加入I.00ul0.VIM氢氧化钠溶液混合,取V0ul混合物在有盖的小样品管中,加入V0ul0.Vmol/LPMP甲醇溶液,并通过涡旋混合器充分混合;将混合物在VII0℃.水浴I.00分钟后,冷却至室温,加入V0ul的0.IIIM盐酸,蒸发溶液至干,加水至I.mL,再加等体积的氯仿,振摇,静置,弃去有机相,如此萃取III次.将水相通过0.IVVum微孔膜过滤后供HPLC进样分析.水解的样品和标准样品的衍生过程必须在相同的条件下同时进行.
III盐藻多糖组分的单糖组成分析
AgilentI.I.00(美国)高效液相色谱仪,包括GI.IIII.I.AIV元泵,GI.IIII.VBDAD检测器,GI.IIII.IIIAII0ul循环自动进样器,GI.IIIVIIIXA在线脱气机,GI.IIII.VBII极管阵列检测器,AgilentI.I.00(美国Agilent公司)化学工作站系统收集的数据;I.个特殊的ZORBAXEclipseXDB-CI.VIIIHPLC柱(IV.VI×IIV0mm,Vum)(美国Agilent公司);室温III0℃;流动相为0.I.M.pHVI.VII的磷酸盐缓冲液-乙腈(VIIIIII:I.VII(v/v,％)),流速为I.ml/min,紫外吸收检测波长:IIIVVnm.PMP的衍生物通过比较峰面积的积分值校准的标准曲线定量分析.
IV结果与讨论
IV.I.单糖PMP衍生物分离的优化
单糖的PMP衍生物的分离,研究了利用各种固定和流动相.通过对固定相为VIII种中性,II种酸性和II种氨基用PMP标记的糖进行快速和有效的分离,最合适的柱子为ZORBAXEclipseXDB-CI.VIII柱,将其与WatersAtlantis-DCI.VIII(Waters,美国),WatersSymmetryCI.VIII(Waters,美国),ZORBAXExtend-CI.VIII(Agilent,美国),HypersilAA-ODS(SMI-LabHutLtd.,英国)和VenusilXBP-CI.VIII(AgelaTechnologiesInc.,美国)相比,ZORBAXEclipseXDB-CI.VIII柱子的分离结果显示为图I..
图I.为单糖标准样品(a)和杜氏盐藻多糖级分PDI.水解样品(b)的PMP衍生化产物的色谱图
对PMP衍生物的保留行为的检查,通过改变0.I.M磷酸盐缓冲液混合物的pH值和用不同比例的乙腈作为流动相进行了研究.不同乙腈的比例对上述PMP标记的VIII种中性糖和两个酸性糖分离的滞留时间的影响结果如图II(a)(缓冲液pHVI.0)所示.结果表明,随着乙腈比例的增加,I.0种糖的PMP衍生物的洗脱过程变得更快,但衍生物的洗脱顺序保持不变,乙腈的比例为I.VII％(V/V)时有较好的分离效果.因为PMP-糖与碱性组充电状态的影响,pH值也对滞留时间和PMP-糖分离效果有明显影响.以乙腈的比例为I.VII％,改变磷酸盐缓冲液pH值对保留时间的影响进行了考察,如图II(b)所示.结果表明:增加了磷酸盐缓冲液pH可以快速洗脱而且衍生物的洗脱顺序保持不变.pH值为VI.VII时洗脱及分离效果较好.此外,当用甲醇作有机溶剂的流动相时,单糖衍生物的分离效果明显差于乙腈.结果显示,VIII种中性.II种酸性糖的PMP衍生物在0.I.M.pHVI.VII的磷酸盐缓冲液和体积分数为I.VII％(体积/体积)的乙腈作为流动相是最佳分离条件.如图I.所示II种氨基糖未在盐藻多糖样品中检测到,所以这两个糖在不同流动相中的保留行为不做研究.
图II是流动相乙腈的百分含量比例(a)和磷酸盐缓冲液pH值(b)对I.0种单糖的PMP衍生物的保留时间的影响
IV.IIPMP衍生化反应的优化
根据文献,PMP衍生化反应时间通常选定为III0分钟(Hondaetal.,I.IXVIIIIX;Strydom,I.IXIXIV)或II小时(Fu&ONeill,I.IXIXV).衍生化反应时间对衍生物峰面积的影响结果如图III所示:图中的数据是III次重复测定的平均值,相对标准偏差为II.I.-IV.VIII％.结果表明每种糖的衍生物的峰面积在不同的衍生反应时间下是不I.样的.反应时间为I.00分钟时,每种糖的衍生物的峰面积显示最大,这比在III0分钟时的峰面积至少大III0%左右,故衍生化反应时间选为I.00分钟.
由于过量的PMP用于衍生化反应,因此,HPLC分析之前,必须用氯仿萃取除去剩余的试剂.PMP中的碱性基团在强酸溶液中,几乎完全被氯仿萃取,由于PMP的质子化作用,在高pH溶液中大部分的PMP-糖也被萃取(Strydom,I.IXIXIV).因为单糖的定量回收对于准确的单糖组成分析是至关重要的,所以提取前的PMP衍生物溶液的pH值是I.个重要的参数;Honda(I.IXVIIIIX)等人用等摩尔的盐酸中和反应溶液中的氢氧化钠.Strydom(I.IXIXIV)和付(I.IXIXV)等人选择用过量的盐酸(pHIII-V)中和溶液.在本文中选择不同体积的HCl(0.IIIM)用于中和溶液,研究PMP衍生物峰面积的变化.结果表明PMP衍生物的峰面积随盐酸量的增加而减少,也许是因为衍生品在酸性溶液中不稳定.当使用V0ul的HCl(等摩尔盐酸)用于中和,除了葡萄糖外大部分的PMP衍生物表现出极大的峰面积和最高检测灵敏度.
图III为衍生反应时间对单糖的PMP衍生物的峰面积的影响
V结论
本文对PMP柱前衍生RP-HPLC法测定多糖的单糖组成的分析条件进行了详细地研究和优化.改进的柱前衍生高效液相色谱法是适用于多糖样品中高分辨率的微量成分的分离且同时进行多种糖类成分分析.盐藻多糖的单糖组成分析是由改进之后的方法来确定的.结果表明,PDI.和PDIVa是分别主要含葡萄糖和半乳糖的酸性杂多糖,并且PDIVa含有硫酸基;PDII和PDIII均为葡聚糖;而PDIVb是以共价键连接核酸的多糖复合物.PDIVa(MW=IVIIIV.IIkDa的)的组成推论是由Fabregas(I.IXIXIX)等证实的:从杜氏盐藻中提取的具有抗病毒活性成分的水提物含有百万级分子量的硫酸多糖,而像PDIVb这种与核酸相连的多糖结构,至今很少报道.
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