木质素主导的植物天敌防御机制在加拿大一枝黄花入侵前后的差异研究
：比较研究原产地（加拿大）以及入侵地（中国）加拿大一枝黄花不同种群、不同生长阶段茎秆中木质素含量的变化和被纤维素酶侵染后还原糖释放量，结果表明：（1）木质素的含量随着植物生长期的增加而增加；（2）被纤维素酶侵染后还原糖释放量随着植物生长期的增加而减少；（3）还原糖释放量和木质素含量呈负相关；（4）入侵地种群木质素含量比原产地种群的木质素高，木质素可促进植物生长发育，说明了加拿大一枝黄入侵过程中，木质素会大量堆积，促进植物的生长发育。关键字：加拿大一枝黄花；木质素；还原糖释放量Study?on?differences?of?lignin-dominated?defense?mechanism?of?plant?predators?before?and?after?Solidago?canadensis?invasionStudent majoring in Biotechnology Li Yingming Tutor Zhang YuAbstract：A comparative study of changes in the lignin content in stems and the release of reducing sugars after the cellulase infesting in different populations , different growth stages of origin (Canada) and intrusion ( China) Solidago Canadensis.The results showed that: (1) the content of lignin increases with the increasing of plant growth ;(2)the release of reducing sugars after the cellulase infesting is reduced with the increasing of plant growth;(3)the release of reducing sugars and lignin content negatively correlated;(4)the lignin content in introduced
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populations content than in origin,lignin can promote plant growth,it explained that in Solidago Canadensis invasion process lignin will be a substantial accumulation to promote growth and development of plants.Key words: Solidago canadensis L1; lignin; sugar release 加拿大一枝黄花（Solidago canadensis L.）为菊科一枝黄花属多年生草本植物，原产于北美，现已成为一种世界性的入侵杂草[1]。加拿大一枝黄花是一组染色体数目不同的亚种或变种组成的多倍复合体，主要染色体倍性有二倍体(2n=18)、四倍体(2n=36)和六倍体(2n=54)3种。于1935年作为庭院花卉引入我国上海、南京等地，随后逸生成为杂草[2]，目前向我国东部地区迅速扩散[3]。该植物容易形成单优势种群落,有很强的竞争优势,并呈现进一步扩散势态[4],它对我国众多区域的社会、经济、自然生态系统和生物多样性构成了严重威胁[5]，。鉴于该物种对入侵地社会经济、自然生态系统和生物多样性构成的严重威胁，各地政府正在投入大量资金对其进行长期的防治和管理。目前，国内外对加拿大一枝黄花的入侵机制已有许多报道，有种理论是从该物种对入侵地被动的适应性变化来阐述入侵机制，如天敌逃逸假说（Enemy escape hypothesis）。天敌逃逸假说认为在入侵植物原产地有许多天敌能够对其种群规模进行有效控制，这些天敌是经过长期的协同进化而产生的，而在新的生境能够调节其种群动态的食草动物或其他天敌数量大大降低，从而导致其分布范围和丰富度增加[6]。在中国，目前为止还没有研究发现存在能有效控制加拿大一枝黄花的天敌[5],从而为加拿大一枝黄花创造了一个良好的生长环境。植物在与天敌相互作用的长期进化过程中，通过各种代谢途径形成了不同的与抵抗天敌有关的防御系统，包括定性防御系统（有毒次生代谢产物）和定量防御系统（抗降解结构物质）[7,8]。其中木质素作为细胞组织抵抗入侵的第一道防护屏障，在植物防御反应中起着重要作用。研究表明木质素代谢与植物的抗病，抗虫，抗涝抗旱等抗逆生理都有一定的相关性[9,10]。在植物防御组织中木质素的存在既作为定量防御，使植物细胞壁能够抵抗天敌攻击所产生的机械压力或天敌消化酶类对细胞壁的降解作用[11,12]；另一方面木质素也具有定性防御的作用，木质素形成过程中还产生一些低分子酚类物质和对天敌有毒的其他代谢产物，限制了天敌对植物的入侵[13,14]。Mohammed指出, 木质素在椰枣 (Phoenix dactylifera L.)诱导抗虫中具有重要作用[15]。因此，本文主要研究在加拿大一枝黄花在入侵过程中，缺少天敌的情况下发生的生态适应性，分析木质素含量随植物生长时间的变化差异。本文将不同种群、不同生长阶段加拿大一枝黄花茎部样本采取高温烘干粉碎处理得到干物质粉末，利用索氏提取法（水 + 乙醇）分别提取干物质内的细胞壁，对细胞壁粉末进行Klason法木质素含量测定，并用纤维素酶侵染各样本细胞壁粉末，采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS）测定细胞壁的还原糖释放量，通过该方法量化各种群茎秆防御组织细胞壁被纤维素酶瓦解的程度。本文有助于我们对外来物种入侵机制的理解，丰富外来植物入侵的“天敌逃逸假说”理论，并有助于找到该物种防御系统的薄弱环节，为该物种生物防控技术的开发提供理论依据。1 材料与方法1．1实验材料本实验的研究材料来源于从原产地（加拿大）以及入侵地（中国）采集来的加拿大一枝黄花种群各10个，并且在同质园条件下种植得到（表1）。表1 加拿大一枝黄花种群Table1 Populations of Solidago canadensis L1入侵地原产地四倍体ZHWUS9四倍体HMUS10四倍体NBMUS14四倍体LYGUS17四倍体XLUS30六倍体WJUS1六倍体NTKUS13六倍体YZTUS14六倍体长兴US17六倍体六安US261．2 试剂和仪器 1．2．1 仪器 分光光度计、电子天平、冷凝管、100mL及250mL烧瓶、 离心管、离心机、水浴锅、真空抽滤器、电热锅。1．2．2 试剂 （1）72%浓硫酸（500mL）的配制：将360mL的分析纯浓硫酸与140mL的蒸馏水混匀，置于棕色细口瓶中，室温保存。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）的配制：取5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2mol/L NaOH溶液中，加入500mL 3mol/L酒石酸钾钠溶液，混匀后，加入5.0g结晶酚和5.0g亚硫酸钠固体，搅拌溶解后，用蒸馏水定容至1000mL。（3）5mg/mL纤维素酶液（250mL）的配制：取1.25g纤维素酶粉末与250mL的蒸馏水混匀，置于烧杯中，现配现用。（4）其他常用试剂：无水乙醇1．3 植株形态特征的测量同质园试验条件下，对不同产地的加拿大一枝黄花测量株高： 选取长势较均匀的植株，用卷尺测量植株地上部分茎长长度，并记录；每个种群完成三个生物学重复。1．4 植物细胞壁的提取1．4．1 植物茎粉末的制备 取上述加拿大一枝黄花入侵地种群和原产地种群6月至10月共98个样本置于烘箱中70oC烘干48h，分别于茎杆粉碎器中处理得到干物质粉末。1．4．2 索氏提取法提取细胞壁 （1）称取不同样本干物质粉末各5.0g，放入直径为2cm的滤筒中，用玻璃纤维丝封口，放入索氏提取器的筒内，用5cm滤纸封好筒的端口。（2）在索氏提取器的烧瓶内加入500mL无水乙醇，连接冷凝管，加热至80-90℃，连续抽提。（3）当筒内提取液颜色变成无色时，停止提取。（4）将滤筒放入通风橱中通风48h至残余的乙醇完全挥发后，再换用蒸馏水重新提取，直至提取液颜色再次变成无色时，停止提取。（5）取出滤筒，通风至完全干燥，称量剩余样品的质量并计算出细胞壁的含量。1．5 木质素提取本文利用Klason法[16]进行木质素提取:（1）称量加拿大一枝黄花细胞壁粉末300±3mg，放入小烧杯中，搅碎；（2）向小烧杯中加入3mL 72%的浓硫酸，用玻璃棒将其混匀，反应2h（加入第一杯时，开始计时），大约30分钟左右搅拌一次；（3）准备50mL量筒取43mL去离子水，分3次左右加入小烧杯中，终止反应，然后倒入烧瓶中，然后放在提前预热好的炉子上加热2h 50min；（4）加热终止，向冷凝管上方加入少量的去离子水冲洗管壁上的残渣，拿出烧瓶冷却1h；（5）将样品置于滤纸中，抽滤，置于烘箱中完全干燥，称重。1．6 纤维素酶侵染试验（1）称量加拿大一枝黄花细胞壁粉末200mg放入10ml离心管，加入3ml 5mg/mL纤维素酶溶液，混匀，放入50℃水浴锅加热0h和7h，每隔30钟左右混匀一次；取一个10ml空离心管加入3ml 5mg/mL纤维素酶溶液作空白对照；（2）吸取样品-纤维素酶溶液混合物1mL放入2mL离心管，然后在离心机12000rpm 离心1min，取上清液750uL放入2mL离心；取两个2ml空离心管，都加入750uL的去离子水，作为分光光度计的调零管。用3 ,5 - 二硝基水杨酸（DNS）比色法[17]测定还原糖含量。1．6．1 3 ,5 - 二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量（1）向装有上清液和去离子的离心管里加入750uL的DNS,混匀后，放入100℃沸水浴加热5min，拿出放入冷水中冷却；（2）根据反应时间的不同，取上清液-DNS混合物100uL-150uL，稀释15-30倍，用分光光度计测量OD540 处的吸光值，最后作DNS标曲进行对照。1．7 还原糖标准曲线的测定 （1）称取葡萄糖500mg放入烧杯中，先加入20ml左右的去离子水使其溶解，再放入50ml的容量瓶中定容，备用，即葡萄糖浓度为1mg/ml；（2）按照下表加样，混匀；表2 还原糖标准曲线的测定Table2 The standard curve of sugar determination管号葡萄糖（ml）去离子水（ml）00210.21.820.41.630.61.440.81.2511量取750uL溶液放入2mL离心，然后加入750uL的DNS，混匀后，放入100℃沸水浴加热5min，拿出放入冷水中冷却；（3）取葡萄糖溶液500uL，稀释5倍，用分光光度计测量OD540 处的吸光值；（4）处理数据，绘制葡萄糖的标准曲线。2 结果与分析2．1 形态特征--株高指标分析测量6月至10月不同生长期入侵地与原产地种群植株的株高，发现入侵地种群普遍长得比较高大，而原产地种群生长得较为矮小。入侵地和原产地种群6月株高平均值分别为109.57cm和71.63cm，二者相差37.94cm；入侵地和原产地种群10月株高平均值分别为207.38cm和107.54cm，二者相差99.84cm。对上述株高结果进行统计学分析，发现入侵地与原产地种群之间株高随着植物生长时间增加差异越明显（图1）。由此得出，加拿大一枝黄花入侵过程，其株高发生明显的演变，表现为植株生长更加迅速，植株更加高大。图1 不同月份入侵地种群与原产地种群植物株高的比较Fig.1. Comparison of height of populations between the origin zones and the invaded zones in different months2．2 细胞壁含量分析对不同种群不同生长时期共98个样本的茎秆粉末进行索氏提取法提取细胞壁并测定其含量，并对得到的结果进行统计学处理,结果如图2所示：入侵地种群6月至10月平均细胞壁含量分别为78.94%、82.35%、83.27%、85.83%、84.58%，原产地种群6月至10月平均细胞壁含量为78.17%、82.09%、82.76%、83.43%、82.95%，不同生长时期不同产地的样本群之间差异均未达到显著水平。结果表明，相同产地的种群中，其细胞壁占细胞总质量的比例随着植株的生长发育变化不显著，而是保持了相对稳定的状态；对比不同产地的种群中，我们发现在相同生长期时，细胞壁含量并没有因为入侵地和原产地的不同而产生差异。由此说明，该物种入侵过程中细胞壁含量无明显变化。图2 不同种群细胞壁百分比含量Fig.2.The percentage content of the cell wall of different populations2．3 木质素含量分析比较木质素在不同生长期的变化，由图3 看出，入侵地和原产地种群木质素含量都是随着生长期的增加而增加的，其中入侵地的木质素含量都比原产地的木质素含量高，通过SPSS软件进行分析，入侵地和原产地种群之间的木质素含量存在显著性差异。该结果说明无论是入侵地种群还是原产地种群的加拿大一枝黄花茎秆生长发育过程中均伴随着木质素的大量堆积。值得注意的是，在相同生长期的条件下，入侵地种群的木质素含量比原产地种群高，说明该物种入侵过程中木质素的代谢发生了变化，入侵地种群茎秆中木质素含量明显增加。同时，结合细胞壁含量的研究结果，我们发现：在相同产地中，随着植株的生长发育，即使细胞壁含量没有发生显著性变化，但细胞壁中木质素却显著增加；相似地，在物种入侵过程中，细胞壁含量也没有发生显著性变化，但细胞壁中木质素含量却发生了大量堆积。图3 入侵地和原产地种群木质素含量的比较Fig.3.Comparison of lignin content of populations between the origin zones and the invaded zones2．4 株高与木质素含量的相关性 为了解该物种迅速生长能力与细胞壁性质之间的关联，我们计算了种群细胞壁木质素含量和植物形态特征株高之间的相关性，结果发现植株木质素含量越高，植株越高，其中入侵地种群与株高的线性关系比原产地种群的线性更加明显（图4），结合株高指标的研究说明植株木质素含量越高生长发育越快，且入侵地比原产地种群生长快，由此说明加拿大一枝黄花入侵过程，细胞壁中木质素会大量堆积，可促进了植物的生长发育。图4 株高与木质素含量的相关性分析Fig.4.Correlation Analysis of height and lignin content2．5 纤维素酶侵染后细胞壁还原糖释放量分析图5显示了加拿大一枝黄花不同种群的细胞壁被纤维素酶侵染后还原糖的释放量。由图5可以看出，还原糖释放量随着生长期的增加而减少，通过SPSS软件进行分析，入侵地和原产地种群之间的还原糖释放量没有显著性差异。该结果表明随着采样时间的增加，加拿大一枝黄花入侵地和原产地种群的茎秆细胞壁粉末对纤维素酶的抵御能力逐步增强了，而入侵地和原产地种群随采样时间的变化，其还原糖释放量没有显著差异。图5 入侵地和原产地种群还原糖释放量的比较Fig.5.Comparison of the release of reducing sugars of populations between the origin zones and the invaded zones2．6 植物生长早期各种群还原糖与木质素含量的相关性分析在植物生长早期，植物的茎秆幼嫩，容易受到病虫害的侵染，为了解植物生长早期其抵御天敌能力与细胞壁性质之间的关联，我们计算了种群细胞壁木质素含量和其受纤维素酶侵染后还原糖释放量之间的相关性，发现原产地种群比入侵地种群木质素平均含量低28.7%，原产地各种群木质素含量差异明显，与还原糖释放量有一定相关性，而入侵地各种群木质素含量差异不明显，与还原糖释放量没有相关性（图6），说明了，在植物生长早期，虽然原产地种群比入侵地种群的木质素含量低，但主要用于防御天敌，而入侵地种群的木质素含量虽多，但用于防御能力不明显。图6 植物生长早期各种群还原糖与木质素含量的相关性分析Fig.6.Correlation Analysis of the reducing sugars and lignin content in each population in the early for plant growth2．7 整体还原糖含量与木质素含量的相关性 为了更好的理解该物种抵御天敌能力与细胞壁性质之间的关联，我们计算了种群细胞壁木质素平均含量和其受纤维素酶侵染后还原糖平均释放量之间的相关性，结果发现二者具有显著负相关性（图7），说明植株木质素含量越多，其受纤维素酶侵染后还原糖释放量越低，从而防御能力强。而原产地和入侵地种群之间还原糖释放量差异不明显，结合植物生长早期各种群还原糖与木质素含量研究，从整个生长期看，入侵地和原产地种群木质素与还原糖的关系差异不明显，而从植物生长早期来看，原产地种群木质素与还原糖释放量存在一定的相关性，而入侵地种群则没有相关性，可以说明，在植株生长早期，原产地种群木质素堆积用于防御天敌，入侵地种群的木质素平均含量比原产地种群高，其用于防御天敌的能力不明显。根据木质素含量的研究，从整体上看。我们发现入侵地种群的木质素含量都比原产地种群高，而两者之间的还原糖释放量差异不明显，由此说明，原产地种群木质素含量虽低，但其产生的是特殊的木质素，可以用于抵御天敌的侵害，而入侵地种群木质素虽多，但抵御天敌能力表现的不明显。 图7 还原糖与木质素含量的相关性分析Fig.7.Correlation Analysis of the reducing sugars and lignin content3 讨论目前，已有许多关于外来入侵物种加拿大一枝黄花的入侵生物学研究，大部分研究认为加拿大一枝黄花的主动入侵能力是其成功入侵的关键因素，即加拿大一枝黄花具有入侵植物的基本特点:生物量大、繁殖力强、生长速度快，并且对胁迫环境具有一定的耐受性[18-21]。同时，该物种对入侵地被动的适应性变化也不容忽视，已有研究表明天敌逃逸学说能够很好地解释某些物种的被动入侵过程[22-24]。在此基础上, 增强竞争力进化假说认为: 外来植物摆脱了原产地的专食性天敌, 在引入地没有或有较少量广食性天敌的情况下, 新的选择压力会驱动植物的防御策略发生进化, 把更多的资源从防御转移到生长繁殖, 进而提高植物的竞争力[25]。研究表明木质素作用：一方面用于对植株抵御外界侵袭能力，另一方面用于促进植物生长发育，加拿大一直黄花入侵过程中，木质素的主动分配对植物入侵起着至关重要的作用。 结合还原糖与木质素的相关性研究，表明植株木质素含量越多，还原糖释放量越少，其植株抵御纤维素酶侵染的能力越强，在植物生长早期，原产地种群木质素主要用于防御天敌，而入侵地种群表现不明显，从整体上看，原产地种群木质素含量比入侵地种群低，而两者之间的还原糖释放量差异不明显，说明原产地种群木质素含量虽低，但产生的是特殊的木质素，可以用来防御天敌的侵害，对于入侵地种群的木质素作用，结合株高与木质素相关性研究，可知入侵地种群的木质素主要分配给了植物的生长发育了，因此说明了，原产地与入侵地加拿大一枝黄花木质素代谢中，原产地种群的木质素堆积主要分配于防御天敌，而入侵后的种群，由于缺少天敌，其木质素堆积主要分配与植物的生长发育。 由于木质素的种类众多，其不同种类的木质素在植物体内所起的作用不同，若要研究原产地种群所产生的木质素的种类和防御作用等，可以在植物生长的早期进行采样，并作进一步的研究，找出影响原产地种群防御能力的木质素种类，并研究其作用于植物防御机理。致谢另外，感谢本实验室中的每位师兄师姐，尤其是常晨师姐，能够及时指出我的不足并积极帮助我，常师姐无私地提供帮助和传授实验心得，同时在生活中我们也成为了好朋友。感谢朱方明同学在论文写作时给予的帮助。参考文献[1] Lu J Z, Weng E S, Wu X W, Weber E, Zhao B, Li B. 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目录
摘要 1
关键字 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1实验材料 2
1．2 试剂和仪器 3
1．2．1 仪器 3
1．2．2 试剂 3
1．3 植株形态特征的测量 3
1．4 植物细胞壁的提取 3
1．4．1 植物茎粉末的制备 3
1．4．2 索氏提取法提取细胞壁 3
1．5 木质素提取 3
1．6 纤维素酶侵染试验 4
1．6．1 3 ,5 二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量 4
1．7 还原糖标准曲线的测定 4
2 结果与分析 4
2．1 形态特征株高指标分析 4
2．2 细胞壁含量分析 5
2．3 木质素含量分析 6
2．4 株高与木质素含量的相关性 6
2．5 纤维素酶侵染后细胞壁还原糖释放量分析 7
2．6 植物生长早期各种群还原糖与木质素含量的相关性分析 8
2．7 整体还原糖含量与木质素含量的相关性 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11
木质素主导的植物天敌防御机制在加拿大一黄花入侵前后的差异研究
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
populations content than in origin,lignin can promote plant growth,it explained that in Solidago Canadensis invasion process lignin will be a substantial accumulation to promote growth and development of plants.Key words: Solidago canadensis L1; lignin; sugar release 加拿大一枝黄花（Solidago canadensis L.）为菊科一枝黄花属多年生草本植物，原产于北美，现已成为一种世界性的入侵杂草[1]。加拿大一枝黄花是一组染色体数目不同的亚种或变种组成的多倍复合体，主要染色体倍性有二倍体(2n=18)、四倍体(2n=36)和六倍体(2n=54)3种。于1935年作为庭院花卉引入我国上海、南京等地，随后逸生成为杂草[2]，目前向我国东部地区迅速扩散[3]。该植物容易形成单优势种群落,有很强的竞争优势,并呈现进一步扩散势态[4],它对我国众多区域的社会、经济、自然生态系统和生物多样性构成了严重威胁[5]，。鉴于该物种对入侵地社会经济、自然生态系统和生物多样性构成的严重威胁，各地政府正在投入大量资金对其进行长期的防治和管理。目前，国内外对加拿大一枝黄花的入侵机制已有许多报道，有种理论是从该物种对入侵地被动的适应性变化来阐述入侵机制，如天敌逃逸假说（Enemy escape hypothesis）。天敌逃逸假说认为在入侵植物原产地有许多天敌能够对其种群规模进行有效控制，这些天敌是经过长期的协同进化而产生的，而在新的生境能够调节其种群动态的食草动物或其他天敌数量大大降低，从而导致其分布范围和丰富度增加[6]。在中国，目前为止还没有研究发现存在能有效控制加拿大一枝黄花的天敌[5],从而为加拿大一枝黄花创造了一个良好的生长环境。植物在与天敌相互作用的长期进化过程中，通过各种代谢途径形成了不同的与抵抗天敌有关的防御系统，包括定性防御系统（有毒次生代谢产物）和定量防御系统（抗降解结构物质）[7,8]。其中木质素作为细胞组织抵抗入侵的第一道防护屏障，在植物防御反应中起着重要作用。研究表明木质素代谢与植物的抗病，抗虫，抗涝抗旱等抗逆生理都有一定的相关性[9,10]。在植物防御组织中木质素的存在既作为定量防御，使植物细胞壁能够抵抗天敌攻击所产生的机械压力或天敌消化酶类对细胞壁的降解作用[11,12]；另一方面木质素也具有定性防御的作用，木质素形成过程中还产生一些低分子酚类物质和对天敌有毒的其他代谢产物，限制了天敌对植物的入侵[13,14]。Mohammed指出, 木质素在椰枣 (Phoenix dactylifera L.)诱导抗虫中具有重要作用[15]。因此，本文主要研究在加拿大一枝黄花在入侵过程中，缺少天敌的情况下发生的生态适应性，分析木质素含量随植物生长时间的变化差异。本文将不同种群、不同生长阶段加拿大一枝黄花茎部样本采取高温烘干粉碎处理得到干物质粉末，利用索氏提取法（水 + 乙醇）分别提取干物质内的细胞壁，对细胞壁粉末进行Klason法木质素含量测定，并用纤维素酶侵染各样本细胞壁粉末，采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS）测定细胞壁的还原糖释放量，通过该方法量化各种群茎秆防御组织细胞壁被纤维素酶瓦解的程度。本文有助于我们对外来物种入侵机制的理解，丰富外来植物入侵的“天敌逃逸假说”理论，并有助于找到该物种防御系统的薄弱环节，为该物种生物防控技术的开发提供理论依据。1 材料与方法1．1实验材料本实验的研究材料来源于从原产地（加拿大）以及入侵地（中国）采集来的加拿大一枝黄花种群各10个，并且在同质园条件下种植得到（表1）。表1 加拿大一枝黄花种群Table1 Populations of Solidago canadensis L1入侵地原产地四倍体ZHWUS9四倍体HMUS10四倍体NBMUS14四倍体LYGUS17四倍体XLUS30六倍体WJUS1六倍体NTKUS13六倍体YZTUS14六倍体长兴US17六倍体六安US261．2 试剂和仪器 1．2．1 仪器 分光光度计、电子天平、冷凝管、100mL及250mL烧瓶、 离心管、离心机、水浴锅、真空抽滤器、电热锅。1．2．2 试剂 （1）72%浓硫酸（500mL）的配制：将360mL的分析纯浓硫酸与140mL的蒸馏水混匀，置于棕色细口瓶中，室温保存。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）的配制：取5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2mol/L NaOH溶液中，加入500mL 3mol/L酒石酸钾钠溶液，混匀后，加入5.0g结晶酚和5.0g亚硫酸钠固体，搅拌溶解后，用蒸馏水定容至1000mL。（3）5mg/mL纤维素酶液（250mL）的配制：取1.25g纤维素酶粉末与250mL的蒸馏水混匀，置于烧杯中，现配现用。（4）其他常用试剂：无水乙醇1．3 植株形态特征的测量同质园试验条件下，对不同产地的加拿大一枝黄花测量株高： 选取长势较均匀的植株，用卷尺测量植株地上部分茎长长度，并记录；每个种群完成三个生物学重复。1．4 植物细胞壁的提取1．4．1 植物茎粉末的制备 取上述加拿大一枝黄花入侵地种群和原产地种群6月至10月共98个样本置于烘箱中70oC烘干48h，分别于茎杆粉碎器中处理得到干物质粉末。1．4．2 索氏提取法提取细胞壁 （1）称取不同样本干物质粉末各5.0g，放入直径为2cm的滤筒中，用玻璃纤维丝封口，放入索氏提取器的筒内，用5cm滤纸封好筒的端口。（2）在索氏提取器的烧瓶内加入500mL无水乙醇，连接冷凝管，加热至80-90℃，连续抽提。（3）当筒内提取液颜色变成无色时，停止提取。（4）将滤筒放入通风橱中通风48h至残余的乙醇完全挥发后，再换用蒸馏水重新提取，直至提取液颜色再次变成无色时，停止提取。（5）取出滤筒，通风至完全干燥，称量剩余样品的质量并计算出细胞壁的含量。1．5 木质素提取本文利用Klason法[16]进行木质素提取:（1）称量加拿大一枝黄花细胞壁粉末300±3mg，放入小烧杯中，搅碎；（2）向小烧杯中加入3mL 72%的浓硫酸，用玻璃棒将其混匀，反应2h（加入第一杯时，开始计时），大约30分钟左右搅拌一次；（3）准备50mL量筒取43mL去离子水，分3次左右加入小烧杯中，终止反应，然后倒入烧瓶中，然后放在提前预热好的炉子上加热2h 50min；（4）加热终止，向冷凝管上方加入少量的去离子水冲洗管壁上的残渣，拿出烧瓶冷却1h；（5）将样品置于滤纸中，抽滤，置于烘箱中完全干燥，称重。1．6 纤维素酶侵染试验（1）称量加拿大一枝黄花细胞壁粉末200mg放入10ml离心管，加入3ml 5mg/mL纤维素酶溶液，混匀，放入50℃水浴锅加热0h和7h，每隔30钟左右混匀一次；取一个10ml空离心管加入3ml 5mg/mL纤维素酶溶液作空白对照；（2）吸取样品-纤维素酶溶液混合物1mL放入2mL离心管，然后在离心机12000rpm 离心1min，取上清液750uL放入2mL离心；取两个2ml空离心管，都加入750uL的去离子水，作为分光光度计的调零管。用3 ,5 - 二硝基水杨酸（DNS）比色法[17]测定还原糖含量。1．6．1 3 ,5 - 二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量（1）向装有上清液和去离子的离心管里加入750uL的DNS,混匀后，放入100℃沸水浴加热5min，拿出放入冷水中冷却；（2）根据反应时间的不同，取上清液-DNS混合物100uL-150uL，稀释15-30倍，用分光光度计测量OD540 处的吸光值，最后作DNS标曲进行对照。1．7 还原糖标准曲线的测定 （1）称取葡萄糖500mg放入烧杯中，先加入20ml左右的去离子水使其溶解，再放入50ml的容量瓶中定容，备用，即葡萄糖浓度为1mg/ml；（2）按照下表加样，混匀；表2 还原糖标准曲线的测定Table2 The standard curve of sugar determination管号葡萄糖（ml）去离子水（ml）00210.21.820.41.630.61.440.81.2511量取750uL溶液放入2mL离心，然后加入750uL的DNS，混匀后，放入100℃沸水浴加热5min，拿出放入冷水中冷却；（3）取葡萄糖溶液500uL，稀释5倍，用分光光度计测量OD540 处的吸光值；（4）处理数据，绘制葡萄糖的标准曲线。2 结果与分析2．1 形态特征--株高指标分析测量6月至10月不同生长期入侵地与原产地种群植株的株高，发现入侵地种群普遍长得比较高大，而原产地种群生长得较为矮小。入侵地和原产地种群6月株高平均值分别为109.57cm和71.63cm，二者相差37.94cm；入侵地和原产地种群10月株高平均值分别为207.38cm和107.54cm，二者相差99.84cm。对上述株高结果进行统计学分析，发现入侵地与原产地种群之间株高随着植物生长时间增加差异越明显（图1）。由此得出，加拿大一枝黄花入侵过程，其株高发生明显的演变，表现为植株生长更加迅速，植株更加高大。图1 不同月份入侵地种群与原产地种群植物株高的比较Fig.1. Comparison of height of populations between the origin zones and the invaded zones in different months2．2 细胞壁含量分析对不同种群不同生长时期共98个样本的茎秆粉末进行索氏提取法提取细胞壁并测定其含量，并对得到的结果进行统计学处理,结果如图2所示：入侵地种群6月至10月平均细胞壁含量分别为78.94%、82.35%、83.27%、85.83%、84.58%，原产地种群6月至10月平均细胞壁含量为78.17%、82.09%、82.76%、83.43%、82.95%，不同生长时期不同产地的样本群之间差异均未达到显著水平。结果表明，相同产地的种群中，其细胞壁占细胞总质量的比例随着植株的生长发育变化不显著，而是保持了相对稳定的状态；对比不同产地的种群中，我们发现在相同生长期时，细胞壁含量并没有因为入侵地和原产地的不同而产生差异。由此说明，该物种入侵过程中细胞壁含量无明显变化。图2 不同种群细胞壁百分比含量Fig.2.The percentage content of the cell wall of different populations2．3 木质素含量分析比较木质素在不同生长期的变化，由图3 看出，入侵地和原产地种群木质素含量都是随着生长期的增加而增加的，其中入侵地的木质素含量都比原产地的木质素含量高，通过SPSS软件进行分析，入侵地和原产地种群之间的木质素含量存在显著性差异。该结果说明无论是入侵地种群还是原产地种群的加拿大一枝黄花茎秆生长发育过程中均伴随着木质素的大量堆积。值得注意的是，在相同生长期的条件下，入侵地种群的木质素含量比原产地种群高，说明该物种入侵过程中木质素的代谢发生了变化，入侵地种群茎秆中木质素含量明显增加。同时，结合细胞壁含量的研究结果，我们发现：在相同产地中，随着植株的生长发育，即使细胞壁含量没有发生显著性变化，但细胞壁中木质素却显著增加；相似地，在物种入侵过程中，细胞壁含量也没有发生显著性变化，但细胞壁中木质素含量却发生了大量堆积。图3 入侵地和原产地种群木质素含量的比较Fig.3.Comparison of lignin content of populations between the origin zones and the invaded zones2．4 株高与木质素含量的相关性 为了解该物种迅速生长能力与细胞壁性质之间的关联，我们计算了种群细胞壁木质素含量和植物形态特征株高之间的相关性，结果发现植株木质素含量越高，植株越高，其中入侵地种群与株高的线性关系比原产地种群的线性更加明显（图4），结合株高指标的研究说明植株木质素含量越高生长发育越快，且入侵地比原产地种群生长快，由此说明加拿大一枝黄花入侵过程，细胞壁中木质素会大量堆积，可促进了植物的生长发育。图4 株高与木质素含量的相关性分析Fig.4.Correlation Analysis of height and lignin content2．5 纤维素酶侵染后细胞壁还原糖释放量分析图5显示了加拿大一枝黄花不同种群的细胞壁被纤维素酶侵染后还原糖的释放量。由图5可以看出，还原糖释放量随着生长期的增加而减少，通过SPSS软件进行分析，入侵地和原产地种群之间的还原糖释放量没有显著性差异。该结果表明随着采样时间的增加，加拿大一枝黄花入侵地和原产地种群的茎秆细胞壁粉末对纤维素酶的抵御能力逐步增强了，而入侵地和原产地种群随采样时间的变化，其还原糖释放量没有显著差异。图5 入侵地和原产地种群还原糖释放量的比较Fig.5.Comparison of the release of reducing sugars of populations between the origin zones and the invaded zones2．6 植物生长早期各种群还原糖与木质素含量的相关性分析在植物生长早期，植物的茎秆幼嫩，容易受到病虫害的侵染，为了解植物生长早期其抵御天敌能力与细胞壁性质之间的关联，我们计算了种群细胞壁木质素含量和其受纤维素酶侵染后还原糖释放量之间的相关性，发现原产地种群比入侵地种群木质素平均含量低28.7%，原产地各种群木质素含量差异明显，与还原糖释放量有一定相关性，而入侵地各种群木质素含量差异不明显，与还原糖释放量没有相关性（图6），说明了，在植物生长早期，虽然原产地种群比入侵地种群的木质素含量低，但主要用于防御天敌，而入侵地种群的木质素含量虽多，但用于防御能力不明显。图6 植物生长早期各种群还原糖与木质素含量的相关性分析Fig.6.Correlation Analysis of the reducing sugars and lignin content in each population in the early for plant growth2．7 整体还原糖含量与木质素含量的相关性 为了更好的理解该物种抵御天敌能力与细胞壁性质之间的关联，我们计算了种群细胞壁木质素平均含量和其受纤维素酶侵染后还原糖平均释放量之间的相关性，结果发现二者具有显著负相关性（图7），说明植株木质素含量越多，其受纤维素酶侵染后还原糖释放量越低，从而防御能力强。而原产地和入侵地种群之间还原糖释放量差异不明显，结合植物生长早期各种群还原糖与木质素含量研究，从整个生长期看，入侵地和原产地种群木质素与还原糖的关系差异不明显，而从植物生长早期来看，原产地种群木质素与还原糖释放量存在一定的相关性，而入侵地种群则没有相关性，可以说明，在植株生长早期，原产地种群木质素堆积用于防御天敌，入侵地种群的木质素平均含量比原产地种群高，其用于防御天敌的能力不明显。根据木质素含量的研究，从整体上看。我们发现入侵地种群的木质素含量都比原产地种群高，而两者之间的还原糖释放量差异不明显，由此说明，原产地种群木质素含量虽低，但其产生的是特殊的木质素，可以用于抵御天敌的侵害，而入侵地种群木质素虽多，但抵御天敌能力表现的不明显。 图7 还原糖与木质素含量的相关性分析Fig.7.Correlation Analysis of the reducing sugars and lignin content3 讨论目前，已有许多关于外来入侵物种加拿大一枝黄花的入侵生物学研究，大部分研究认为加拿大一枝黄花的主动入侵能力是其成功入侵的关键因素，即加拿大一枝黄花具有入侵植物的基本特点:生物量大、繁殖力强、生长速度快，并且对胁迫环境具有一定的耐受性[18-21]。同时，该物种对入侵地被动的适应性变化也不容忽视，已有研究表明天敌逃逸学说能够很好地解释某些物种的被动入侵过程[22-24]。在此基础上, 增强竞争力进化假说认为: 外来植物摆脱了原产地的专食性天敌, 在引入地没有或有较少量广食性天敌的情况下, 新的选择压力会驱动植物的防御策略发生进化, 把更多的资源从防御转移到生长繁殖, 进而提高植物的竞争力[25]。研究表明木质素作用：一方面用于对植株抵御外界侵袭能力，另一方面用于促进植物生长发育，加拿大一直黄花入侵过程中，木质素的主动分配对植物入侵起着至关重要的作用。 结合还原糖与木质素的相关性研究，表明植株木质素含量越多，还原糖释放量越少，其植株抵御纤维素酶侵染的能力越强，在植物生长早期，原产地种群木质素主要用于防御天敌，而入侵地种群表现不明显，从整体上看，原产地种群木质素含量比入侵地种群低，而两者之间的还原糖释放量差异不明显，说明原产地种群木质素含量虽低，但产生的是特殊的木质素，可以用来防御天敌的侵害，对于入侵地种群的木质素作用，结合株高与木质素相关性研究，可知入侵地种群的木质素主要分配给了植物的生长发育了，因此说明了，原产地与入侵地加拿大一枝黄花木质素代谢中，原产地种群的木质素堆积主要分配于防御天敌，而入侵后的种群，由于缺少天敌，其木质素堆积主要分配与植物的生长发育。 由于木质素的种类众多，其不同种类的木质素在植物体内所起的作用不同，若要研究原产地种群所产生的木质素的种类和防御作用等，可以在植物生长的早期进行采样，并作进一步的研究，找出影响原产地种群防御能力的木质素种类，并研究其作用于植物防御机理。致谢另外，感谢本实验室中的每位师兄师姐，尤其是常晨师姐，能够及时指出我的不足并积极帮助我，常师姐无私地提供帮助和传授实验心得，同时在生活中我们也成为了好朋友。感谢朱方明同学在论文写作时给予的帮助。参考文献[1] Lu J Z, Weng E S, Wu X W, Weber E, Zhao B, Li B. 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目录
摘要 1
关键字 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1实验材料 2
1．2 试剂和仪器 3
1．2．1 仪器 3
1．2．2 试剂 3
1．3 植株形态特征的测量 3
1．4 植物细胞壁的提取 3
1．4．1 植物茎粉末的制备 3
1．4．2 索氏提取法提取细胞壁 3
1．5 木质素提取 3
1．6 纤维素酶侵染试验 4
1．6．1 3 ,5 二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量 4
1．7 还原糖标准曲线的测定 4
2 结果与分析 4
2．1 形态特征株高指标分析 4
2．2 细胞壁含量分析 5
2．3 木质素含量分析 6
2．4 株高与木质素含量的相关性 6
2．5 纤维素酶侵染后细胞壁还原糖释放量分析 7
2．6 植物生长早期各种群还原糖与木质素含量的相关性分析 8
2．7 整体还原糖含量与木质素含量的相关性 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11
木质素主导的植物天敌防御机制在加拿大一黄花入侵前后的差异研究
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