贫营养微生物制剂研发与应用研究
目 录
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2 贫营养微生物制剂的发展现状 2
1.3 海藻酸钠包埋技术的简介 4
1.4 本课题的研究意义 5
1.5 研究方法及内容 5
2实验部分 7
2.1实验仪器 7
2.2实验药品 8
3实验结果与讨论 10
3.1海藻酸钠浓度对固定微生物制剂强度的影响 10
3.2海藻酸钠浓度对制剂包埋率的影响 11
3.3氯化钙浓度对制剂包埋率的影响 12
3.4海藻酸钠凝胶珠大小对包埋率的影响 13
3.4包菌量对净水效果的影响 14
3.5 菌剂的耐酸碱性能测评 15
3.6 菌剂的其他抗性测评 16
3.7 菌剂的有机物降解能力及净水效果测评 18
3.8菌剂的包存时间对其各性质的影响 19
结论 22
致谢 22
参考文献 24
1 绪论
1.1 研究背景
微生物固定化技术是20世纪60年代发展起来的一项新技术。Hattori等人首次实现了大肠杆菌的固定化。微生物固定化技术,是利用物理或化学手段将游离的微生物(细胞)或酶,定位于限定的空间区域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。最初人们将这项技术用于滴滤反应系统内发酵以及生产醋酸[1]。后来，人们将微生物固定化技术用于食品、医药、发酵工业中，近些年来，在废水处理领域，这一技术也得到了很好的发展，显示出其独特的优越性[17]。20世纪70年代后期，随着水环境污染的日益严重，逐渐开始了生物处理废水的研究。
微 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
生物经固定化技术固载后，其活性或性能得到改善，使单位体积内的生物密度增大固定化微生物同游离菌体比较，具有以下优点：
(1)增加了连续循环反应过程的运用可以更好的发挥持续降解性能，避免了反应过程中的流失，并且可以用较简单的方法回收利用。
(2)增加了其稳定性固定化的菌体可以延长生物活性和稳定性，载体可以对菌体起到保护作用，以免外界体系中条件的影响，比如pH温度底物浓度以及有机溶剂有毒物质等。
(3)更适合于工业生产中的连续化自动化过程控制，使工艺流程得以简化，便于调节。
(4)更有利于固定化细胞与产物的有效分离，改善了后处理过程，简化了工艺流程，提高了固定化微生物的利用效率，从而大大降低了资金成本
(5)固定化微生物可以长期批量操作，无须将菌体从反应器中移出使菌体更加适应处理环境，性能发挥更加稳定，应用前景更为广阔[1]。
而利用微生物固定化技术处理污水与其他环境治理技术相比，具有以下特点：微生物固定化后可保持反应器内微生物的高浓度和高活性，有助于提高污染物的去除效率；采用固定化微生物技术工艺处理污水，污泥产量低，可减轻后续污泥处置的负担；微生物固定化可形成颗粒态, 有利于沉淀过程的泥水分离；具有固定化某些难降解有机物的特性，可有效处理某些行业的废水；微生物固定化后对有毒物质的承受能力强、稳定性好。因此，近几年来在环境污染治理方面对微生物固定化技术进行了广泛研究和深入探讨，而微生物固定化技术也成为国内外废水处理领域的研究热点。为了满足在贫营养条件下污染处理的需要，对贫营养微生物制剂的研发与应用研究显得尤为重要[2]。
而在这些微生物细胞固定化技术中，包埋法是近年来发展迅速的一种新兴细胞固定化技术，具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法。常用的包埋载体有琼脂、明胶、海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)和丙烯酰胺(ACRM)。
1.2 贫营养微生物制剂的发展现状
微生物细胞固定化的方法多种多样，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用来对微生物细胞进行固定化。国内外没有统一的分类标准，根据对各种方法的分析，可将其分为物理固定法和化学固定法两大类。物理固定法主要有吸附法、 包埋法、包络法，化学固定法包括共价结合法和交联法等[24]。
如下图：
图1-1微生物固定方法
1.2.1 吸附法
吸附法是一种非常廉价和有效、比较常用的微生物固定化方法。吸附法可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、焦炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化。离子吸附是利用微生物在解离状态下离子健合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上, 常见的离子交换剂有DEAE-纤维素、CM-纤维素等[2]。吸附法实现简单，操作容易，反应条件温和，载体可重复使用，但微生物与载体的结合力较弱，稳定性差，微生物菌体易脱落[7]。
1.2.2 包埋法
包埋法是将微生物细胞用物理方法包埋在各种载体之中。根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两种[17]。即将细胞包埋在凝胶等物质内部的微孔中或由各种高分子聚合物制成的凝胶珠内。包埋法操作简单，条 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
件温和, 对细胞活性影响小，制作的固定化细胞球强度高，是目前研究最广泛的方法[4]。
肖美燕等对包埋法固定化技术的特点、常用包埋剂的包埋方法、改性研究等进行了综述。曾成鸣等首次将人红细胞固着在凝胶颗粒中,利用细胞生物色谱研究了红细胞膜上葡萄糖传输蛋白Glu1的活性[9]。
1.2.3 交联法
交联法是通过微生物与具有两个或两个以上官能基团的试剂反应，使微生物菌体相互连接成网状结构而达到固定化微生物的目的。最为常见的交联剂是戊二醛。Smiley使用苯酚甲醛树脂DuoliteDS一73141、来吸附枯草芽孢杆菌的a-淀粉酶，再用戊二醛交联，形成酶-树脂复合物，用于连续水解造纸废水中悬浮微纤维的胶态淀粉，效果很理想[21]。
交联法中微生物结合强度高，稳定性好，耐反应环境的变化能力强，但微生物的活性有较大的损失，同时交联剂比较昂贵，这些都限制了该方法的应用[11]。
1.2.4 共价结合法
共价结合法是细胞表面功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接,从而成为固定化细胞。该法细胞与载体结合紧密,使用过程中不易脱落,但反应激烈、条件较难控制,往往容易造成细胞的死亡,应用并不广泛[10]。
1.2.5 絮凝法
絮凝法是利用某些微生物细胞具有自絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法，即无载体固定化细胞。
传统固定化技术的研究目前虽然已经非常深入，但在固定方法和使用过程中，不同程度地存在着这样或那样的缺点所以新技术的研究与开发一直是固定化技术的重要任务，有待从以下几个方面加以改善。
1.5 研究方法及内容
本课题属于探索性实验，利用海藻酸钠和淀粉对同组人员培养的贫营养条件下的净水细菌进行富集后包埋，产生海藻酸钠凝胶珠，经过净水效率和各种性质的测试从而得出在贫营养条件下包埋后海藻酸钠凝胶珠对于未包埋的净水细菌有何优点以及特征。
凝胶珠直径（mm） 1 2 3
活菌数(107cfu/g) 1.87 2.15 1.74
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2 贫营养微生物制剂的发展现状 2
1.3 海藻酸钠包埋技术的简介 4
1.4 本课题的研究意义 5
1.5 研究方法及内容 5
2实验部分 7
2.1实验仪器 7
2.2实验药品 8
3实验结果与讨论 10
3.1海藻酸钠浓度对固定微生物制剂强度的影响 10
3.2海藻酸钠浓度对制剂包埋率的影响 11
3.3氯化钙浓度对制剂包埋率的影响 12
3.4海藻酸钠凝胶珠大小对包埋率的影响 13
3.4包菌量对净水效果的影响 14
3.5 菌剂的耐酸碱性能测评 15
3.6 菌剂的其他抗性测评 16
3.7 菌剂的有机物降解能力及净水效果测评 18
3.8菌剂的包存时间对其各性质的影响 19
结论 22
致谢 22
参考文献 24
1 绪论
1.1 研究背景
微生物固定化技术是20世纪60年代发展起来的一项新技术。Hattori等人首次实现了大肠杆菌的固定化。微生物固定化技术,是利用物理或化学手段将游离的微生物(细胞)或酶,定位于限定的空间区域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。最初人们将这项技术用于滴滤反应系统内发酵以及生产醋酸[1]。后来，人们将微生物固定化技术用于食品、医药、发酵工业中，近些年来，在废水处理领域，这一技术也得到了很好的发展，显示出其独特的优越性[17]。20世纪70年代后期，随着水环境污染的日益严重，逐渐开始了生物处理废水的研究。
微 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
生物经固定化技术固载后，其活性或性能得到改善，使单位体积内的生物密度增大固定化微生物同游离菌体比较，具有以下优点：
(1)增加了连续循环反应过程的运用可以更好的发挥持续降解性能，避免了反应过程中的流失，并且可以用较简单的方法回收利用。
(2)增加了其稳定性固定化的菌体可以延长生物活性和稳定性，载体可以对菌体起到保护作用，以免外界体系中条件的影响，比如pH温度底物浓度以及有机溶剂有毒物质等。
(3)更适合于工业生产中的连续化自动化过程控制，使工艺流程得以简化，便于调节。
(4)更有利于固定化细胞与产物的有效分离，改善了后处理过程，简化了工艺流程，提高了固定化微生物的利用效率，从而大大降低了资金成本
(5)固定化微生物可以长期批量操作，无须将菌体从反应器中移出使菌体更加适应处理环境，性能发挥更加稳定，应用前景更为广阔[1]。
而利用微生物固定化技术处理污水与其他环境治理技术相比，具有以下特点：微生物固定化后可保持反应器内微生物的高浓度和高活性，有助于提高污染物的去除效率；采用固定化微生物技术工艺处理污水，污泥产量低，可减轻后续污泥处置的负担；微生物固定化可形成颗粒态, 有利于沉淀过程的泥水分离；具有固定化某些难降解有机物的特性，可有效处理某些行业的废水；微生物固定化后对有毒物质的承受能力强、稳定性好。因此，近几年来在环境污染治理方面对微生物固定化技术进行了广泛研究和深入探讨，而微生物固定化技术也成为国内外废水处理领域的研究热点。为了满足在贫营养条件下污染处理的需要，对贫营养微生物制剂的研发与应用研究显得尤为重要[2]。
而在这些微生物细胞固定化技术中，包埋法是近年来发展迅速的一种新兴细胞固定化技术，具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法。常用的包埋载体有琼脂、明胶、海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)和丙烯酰胺(ACRM)。
1.2 贫营养微生物制剂的发展现状
微生物细胞固定化的方法多种多样，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用来对微生物细胞进行固定化。国内外没有统一的分类标准，根据对各种方法的分析，可将其分为物理固定法和化学固定法两大类。物理固定法主要有吸附法、 包埋法、包络法，化学固定法包括共价结合法和交联法等[24]。
如下图：
图1-1微生物固定方法
1.2.1 吸附法
吸附法是一种非常廉价和有效、比较常用的微生物固定化方法。吸附法可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、焦炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化。离子吸附是利用微生物在解离状态下离子健合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上, 常见的离子交换剂有DEAE-纤维素、CM-纤维素等[2]。吸附法实现简单，操作容易，反应条件温和，载体可重复使用，但微生物与载体的结合力较弱，稳定性差，微生物菌体易脱落[7]。
1.2.2 包埋法
包埋法是将微生物细胞用物理方法包埋在各种载体之中。根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两种[17]。即将细胞包埋在凝胶等物质内部的微孔中或由各种高分子聚合物制成的凝胶珠内。包埋法操作简单，条 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
件温和, 对细胞活性影响小，制作的固定化细胞球强度高，是目前研究最广泛的方法[4]。
肖美燕等对包埋法固定化技术的特点、常用包埋剂的包埋方法、改性研究等进行了综述。曾成鸣等首次将人红细胞固着在凝胶颗粒中,利用细胞生物色谱研究了红细胞膜上葡萄糖传输蛋白Glu1的活性[9]。
1.2.3 交联法
交联法是通过微生物与具有两个或两个以上官能基团的试剂反应，使微生物菌体相互连接成网状结构而达到固定化微生物的目的。最为常见的交联剂是戊二醛。Smiley使用苯酚甲醛树脂DuoliteDS一73141、来吸附枯草芽孢杆菌的a-淀粉酶，再用戊二醛交联，形成酶-树脂复合物，用于连续水解造纸废水中悬浮微纤维的胶态淀粉，效果很理想[21]。
交联法中微生物结合强度高，稳定性好，耐反应环境的变化能力强，但微生物的活性有较大的损失，同时交联剂比较昂贵，这些都限制了该方法的应用[11]。
1.2.4 共价结合法
共价结合法是细胞表面功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接,从而成为固定化细胞。该法细胞与载体结合紧密,使用过程中不易脱落,但反应激烈、条件较难控制,往往容易造成细胞的死亡,应用并不广泛[10]。
1.2.5 絮凝法
絮凝法是利用某些微生物细胞具有自絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法，即无载体固定化细胞。
传统固定化技术的研究目前虽然已经非常深入，但在固定方法和使用过程中，不同程度地存在着这样或那样的缺点所以新技术的研究与开发一直是固定化技术的重要任务，有待从以下几个方面加以改善。
1.5 研究方法及内容
本课题属于探索性实验，利用海藻酸钠和淀粉对同组人员培养的贫营养条件下的净水细菌进行富集后包埋，产生海藻酸钠凝胶珠，经过净水效率和各种性质的测试从而得出在贫营养条件下包埋后海藻酸钠凝胶珠对于未包埋的净水细菌有何优点以及特征。
凝胶珠直径（mm） 1 2 3
活菌数(107cfu/g) 1.87 2.15 1.74
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