禽流感病毒H9N2基因片段血凝素(HA)对小鼠树突状细胞mirna的影响
禽流感病毒H9N2基因片段血凝素(HA)对小鼠树突状细胞mirna的影响[20200614170249]
摘要：为了研究血凝素（HA）蛋白对小鼠树突状细胞mirna的影响,本实验首先提取H9N2禽流感病毒的RNA，扩增血凝素片段（HA，1682bp,JF-795078.1）；其次将测序正确的HA片段双酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-HA；然后分离培养树突状小鼠细胞。本研究成功从鸡胚尿囊液病毒中扩增出1682bp的血凝素片段；经测序验证与参考株序列（JF-795078.1）99%同源。双酶切（使用KpnI和XhoI酶切出CTCGAG目的片段）鉴定结果显示真核表达载体构建正确。倒置显微镜下观察分离的树突状细胞，在第四天出现明显的集落现象，在第七天树突状细胞表现出明显的树突。本次试验通过研究H9N2亚型禽流感病毒片段血凝素(HA)的提取，作用在小鼠树突状细胞，观察其对小鼠树突状细胞miRNA的影响。若该片段对树突状细胞的影响大，证明HA是对免疫系统有着重要作用的一个禽流感病毒片段，对今后流感病毒疫苗的研制和的人体免疫系统的提升有着重要影响。实验最终成功扩增出目标载体，为之后感染细胞打下了良好基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:禽流感病毒；树突状细胞；mirna
目录
摘要 5
关键词 6
Abstract. 6
引言
引言
1. 材料与方法 8
1.1实验材料 8
1.1.1实验材料 8
1.1.2实验动物 8
1.1.3实验试剂 8
1.1.4实验器材 8
1.2实验方案 9
1.2.1 PCR扩增 9
1.2.1.1Trizol法提取H9N2尿囊液病毒RNA 9
1.2.1.2将提取的总RNA进行RT-PCR扩增，形成cDNA，并进行引物设计 9
1.2.1.3连接转化 10
1.2.1.4菌落PCR 11
1.2.1.5质粒提取及测序 11
1.2.2表达载体的构建 13
1.2.3小鼠骨髓来源树突状细胞体外诱导培养及鉴定 13
2. 结果和分析 14
2.1 PCR扩增 14
2.2 Blast序列比对结果 15
2.3小鼠树突状细胞培养 17
3. 讨论 18
致谢 19
参考文献 19
禽流感病毒H9N2基因片段（HA）对小鼠树突状细胞mirna的影响
The influence of H9N2 virus gene (HA) to dendritic cells in mice of micrornas
Student majoring in biotechnology Wang Zhi
Tutor Li Jian
Abstract: In order to st *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
udy haemagglutinin (HA) protein on dendritic cells in mice of micrornas,the experiment first extract H9N2 avian influenza virus RNA, amplification hemagglutinin fragment(HA,1682bp,JF-795078.1);then after sequencing the right segments of the HA double enzyme is connected to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 built on eukaryotic expression vector pcDNA3.1 - HA ;then cultivation and dendritic cells in mice. In this study, the ultimate success of the virus from allantoic fluid amplified fragment of 1404bp of neuraminidase , verified by sequencing with the reference strain sequence (NC-004909) 99% homology .Double digestion ( using KPNI and XhoI restriction fragment of CTCGAG ) identification showed the eukaryotic expression vector was constructed correctly . Inverted microscope isolated dendritic cells , colonies were apparent on the fourth day of the phenomenon , on the seventh day showed significant dendritic cells Dendritic . This experiment by studying the segments of H9N2 subtype of avian influenza virus hemagglutinin (HA), the extraction of dendritic cells in mice, the influence of the dendritic cells of micrornas in mice was observed. If the segments influence on dendritic cells, proved the HA on the immune system will play an important role of the development of the influenza virus vaccine and the ascension of the human immune system.After experimental managed to amplify the target vehicles for infected cells l *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
aid a good foundation.
Key words:the bird flu virus；dendritic cells；micrornas
引言
禽流感又称人感染禽流感，其属于甲型流感病毒[9]，21世纪以来频繁在世界各地发生，收到了各国的广泛关注。每年因禽流感病毒而造成的经济、人员损失时非常惊人的，因此，这方面的研究也越来越收到国家的重视。
禽流感病毒（AIV）为正黏病毒科流感病毒属，典型的AIV粒子形态为呈球，直径为80-120nm不等，是一种有囊膜的RNA病毒[8]。禽流感(Avianhifluenza,Al)是由禽流感病毒(AvianhifluenzaVirus,AIV)引起的多种动物易感传染病,不仅在禽类、猪等动物间发生传染，其中H5N1、H7N7、H9N2等亚型禽流感病毒会发生感染人的现象。是危害世界养禽业的重要传染病之一，社会上爆发流感传染病的历史中也有很多是由于禽流感病毒感染的[1]。而且禽流感病毒突变几率高，对疫苗研发是一种阻碍，因此更深入的了解流感病毒宿主限制的生物学和遗传学基础，是确定一种新的流感病毒能否在人类之间暴发流行的关键。
禽流感病毒往往具有较高的突变率，而在其编码的蛋白中，又以血凝素(HA)的突变频率最高，是其变异、毒力和宿主特异性的主要决定因素。HA是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分，也是流感病毒主要表面抗原和保护性抗原，能刺激机体产生中和抗体。HA裂解位点氨基酸序列是决定禽流感病毒致病性和毒力强弱的关键性因素之一。[2]因此本次研究是对 H9N2 禽流感病毒分离株第4号片段HA进行了分子遗传变异研究，为我国 H9N2 禽流感的防治提供理论依据。
树突状细胞[3]（Dendritic cell , DC）是目前所知的功能最强的抗原递呈细胞细胞，是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。它们通常少量分布于与外界接触的皮肤(黏膜)部位。 血液中也可发现他们的未成熟型式。他们被活化时，会移至淋巴组织中与T细胞与B细胞互相作用，以刺激与控制适当的免疫反应。
摘要：为了研究血凝素（HA）蛋白对小鼠树突状细胞mirna的影响,本实验首先提取H9N2禽流感病毒的RNA，扩增血凝素片段（HA，1682bp,JF-795078.1）；其次将测序正确的HA片段双酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-HA；然后分离培养树突状小鼠细胞。本研究成功从鸡胚尿囊液病毒中扩增出1682bp的血凝素片段；经测序验证与参考株序列（JF-795078.1）99%同源。双酶切（使用KpnI和XhoI酶切出CTCGAG目的片段）鉴定结果显示真核表达载体构建正确。倒置显微镜下观察分离的树突状细胞，在第四天出现明显的集落现象，在第七天树突状细胞表现出明显的树突。本次试验通过研究H9N2亚型禽流感病毒片段血凝素(HA)的提取，作用在小鼠树突状细胞，观察其对小鼠树突状细胞miRNA的影响。若该片段对树突状细胞的影响大，证明HA是对免疫系统有着重要作用的一个禽流感病毒片段，对今后流感病毒疫苗的研制和的人体免疫系统的提升有着重要影响。实验最终成功扩增出目标载体，为之后感染细胞打下了良好基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:禽流感病毒；树突状细胞；mirna
目录
摘要 5
关键词 6
Abstract. 6
引言
引言
1. 材料与方法 8
1.1实验材料 8
1.1.1实验材料 8
1.1.2实验动物 8
1.1.3实验试剂 8
1.1.4实验器材 8
1.2实验方案 9
1.2.1 PCR扩增 9
1.2.1.1Trizol法提取H9N2尿囊液病毒RNA 9
1.2.1.2将提取的总RNA进行RT-PCR扩增，形成cDNA，并进行引物设计 9
1.2.1.3连接转化 10
1.2.1.4菌落PCR 11
1.2.1.5质粒提取及测序 11
1.2.2表达载体的构建 13
1.2.3小鼠骨髓来源树突状细胞体外诱导培养及鉴定 13
2. 结果和分析 14
2.1 PCR扩增 14
2.2 Blast序列比对结果 15
2.3小鼠树突状细胞培养 17
3. 讨论 18
致谢 19
参考文献 19
禽流感病毒H9N2基因片段（HA）对小鼠树突状细胞mirna的影响
The influence of H9N2 virus gene (HA) to dendritic cells in mice of micrornas
Student majoring in biotechnology Wang Zhi
Tutor Li Jian
Abstract: In order to st *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
udy haemagglutinin (HA) protein on dendritic cells in mice of micrornas,the experiment first extract H9N2 avian influenza virus RNA, amplification hemagglutinin fragment(HA,1682bp,JF-795078.1);then after sequencing the right segments of the HA double enzyme is connected to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 built on eukaryotic expression vector pcDNA3.1 - HA ;then cultivation and dendritic cells in mice. In this study, the ultimate success of the virus from allantoic fluid amplified fragment of 1404bp of neuraminidase , verified by sequencing with the reference strain sequence (NC-004909) 99% homology .Double digestion ( using KPNI and XhoI restriction fragment of CTCGAG ) identification showed the eukaryotic expression vector was constructed correctly . Inverted microscope isolated dendritic cells , colonies were apparent on the fourth day of the phenomenon , on the seventh day showed significant dendritic cells Dendritic . This experiment by studying the segments of H9N2 subtype of avian influenza virus hemagglutinin (HA), the extraction of dendritic cells in mice, the influence of the dendritic cells of micrornas in mice was observed. If the segments influence on dendritic cells, proved the HA on the immune system will play an important role of the development of the influenza virus vaccine and the ascension of the human immune system.After experimental managed to amplify the target vehicles for infected cells l *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
aid a good foundation.
Key words:the bird flu virus；dendritic cells；micrornas
引言
禽流感又称人感染禽流感，其属于甲型流感病毒[9]，21世纪以来频繁在世界各地发生，收到了各国的广泛关注。每年因禽流感病毒而造成的经济、人员损失时非常惊人的，因此，这方面的研究也越来越收到国家的重视。
禽流感病毒（AIV）为正黏病毒科流感病毒属，典型的AIV粒子形态为呈球，直径为80-120nm不等，是一种有囊膜的RNA病毒[8]。禽流感(Avianhifluenza,Al)是由禽流感病毒(AvianhifluenzaVirus,AIV)引起的多种动物易感传染病,不仅在禽类、猪等动物间发生传染，其中H5N1、H7N7、H9N2等亚型禽流感病毒会发生感染人的现象。是危害世界养禽业的重要传染病之一，社会上爆发流感传染病的历史中也有很多是由于禽流感病毒感染的[1]。而且禽流感病毒突变几率高，对疫苗研发是一种阻碍，因此更深入的了解流感病毒宿主限制的生物学和遗传学基础，是确定一种新的流感病毒能否在人类之间暴发流行的关键。
禽流感病毒往往具有较高的突变率，而在其编码的蛋白中，又以血凝素(HA)的突变频率最高，是其变异、毒力和宿主特异性的主要决定因素。HA是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分，也是流感病毒主要表面抗原和保护性抗原，能刺激机体产生中和抗体。HA裂解位点氨基酸序列是决定禽流感病毒致病性和毒力强弱的关键性因素之一。[2]因此本次研究是对 H9N2 禽流感病毒分离株第4号片段HA进行了分子遗传变异研究，为我国 H9N2 禽流感的防治提供理论依据。
树突状细胞[3]（Dendritic cell , DC）是目前所知的功能最强的抗原递呈细胞细胞，是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。它们通常少量分布于与外界接触的皮肤(黏膜)部位。 血液中也可发现他们的未成熟型式。他们被活化时，会移至淋巴组织中与T细胞与B细胞互相作用，以刺激与控制适当的免疫反应。
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