大肠杆菌胞内辅因子乙酰辅酶a的调控机制的建立
我国是油脂资源短缺的国家，并且食用油脂安全问题时有发生，所以寻找新方法生产油脂和提升油脂的产量显得尤为重要。脂肪酸分为短链、中链和长链脂肪酸三种，其中，中链脂肪酸的应用价值最大，具有消化吸收快、不形成脂肪积累等特点。在食品、医药、基因工程等营养相关方面以及保健食品的开发和利用方面有着广泛的应用。目前合成中链脂肪酸最为高效的途径是功能逆转的β-氧化循环途径，该途径需要以乙酰辅酶A作为终产物脂肪酸的前体物质，而本实验我们将通过利用基于cas9系统的基因编辑技术对大肠杆菌基因组上的5个基因序列进行敲除，干扰胞内乙酰辅酶A向丙酮酸、乙醇等其他代谢产物通路，从而提高前体物质乙酰辅酶A含量以提高终产物脂肪酸的含量。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1 材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1原料 4
1.1.2菌种培养、纯化用培养基4
1.1.3试剂盒和相关酶4
1.1.4主要仪器与设备4
1.2实验方法5
1.2.1基因敲除5
1.2.2菌株发酵 7
2 结果与分析 8
2.1 基因敲除菌株的获得8
2.1.1 pta基因的敲除 8
2.1.2 frdA基因的敲除9
2.1.3 poxB基因的敲除 11
2.1.4 adhE基因的敲除 12
2.1.5 ldhA、pta基因的敲除14
2.1.6 ldhA、pta、frdA基因的敲除15
2.1.7 ldhA、pta、frdA、poxB基因的敲除17
2.1.8 ldhA、pta、frdA、poxB、adhE基因的敲除18
2.2 脂肪酸产量验证20
3 讨论 21
致谢21
参考文献21
大肠杆菌胞内辅因子乙酰辅酶A的调控机制建立
引言
脂肪酸根据碳链的长短能分为短、中和长链脂肪酸三种，其中中链脂肪酸是指含612个碳原子的碳链的脂肪酸。天然油脂中 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
含有比较少的中链脂肪酸，在自然界中主要来自于母乳、牛奶及其制品、棕榈仁油和椰子油等。作为一种平台化合物的脂肪酸，在多个不同的领域内被普遍应用。烷/烯烃和脂肪酸酯这些衍生物与短链醇相比能量密度更高，而且与汽油相比没有10% ～ 20% 的混合壁垒，被认做是更有潜力的燃料替代品。而其衍生的脂肪醇和三酰甘油及其它衍生物的亲疏水性较为优良，是多种化工业品如洗涤剂、润滑剂、化妆品和药物等的主要原料。然而目前来看脂肪酸主要是从石油或动植物中提取，存在可持续性差等一系列问题，因而利用微生物高效地合成中链脂肪酸成为了近年来的研究热点[12].
肥胖会增加Ⅱ 型糖尿病、心血管疾病及某些癌症的发病率，显然已经成为人们日益关注的健康问题。尤其是从最近几年来看，与日俱增的肥胖的发病率，和饮食习惯和结构的变化有关系，更为重要的是由于过多地摄入含高热量的食物，如单糖类、饱和脂肪等，并且还和慵懒的生活习性有关[5]。因此，将膳食中脂肪酸的种类和组成进行调节显得尤为重要。近几年的研究显示，中链脂肪酸和长链脂肪酸相比具有消化吸收快、不形成脂肪积累等特点, 还具有减少脂肪堆积、改善胰岛素抵抗、调节能量代谢及抑制微生物等生物学功能，同时还具有抗菌、抗病毒、抗癌[18]、促进维生素吸收和降低炎性细胞因子产生的作用。在食品、医药、基因工程等营养相关方面有着广泛应用, 保健食品的开发和利用方面展现出巨大的潜力[1921]。同时由于MCFA或MCT 和长链脂肪酸(LCFA)或长链甘油三酯 (LCT)特殊的生理生化特性的不同,也可被用于人类的临床治疗(如胃肠炎、肥胖症、糖尿病), 或者用来为脂肪代谢障碍的患者和早产婴儿提供能量[2829]。MCFA 或MCT也可用于初生仔猪和鸡的饲养当中, 并已经对这方面做了一定基础的研究[2]。
自然界中的很多微生物，如霉菌、酵母菌、细菌等，能够在一定的条件下利用碳源合成并积累油脂。因为脂肪酸可以转化成多种食用油脂、生物能源、工业化学品，所以利用微生物来生产脂肪酸越来越被受到重视，并有望替代一部分植物油脂[67]。而大肠杆菌是作为一个生产脂肪酸具有吸引力的宿主生物，由于它的快速复制率、较高的生长速率，及可以生长在各种碳源中。除此大肠杆菌还拥有多种遗传操作工具用来改善菌株的性能和易高密度发酵等特性。也由于通过对大肠杆菌代谢工程的改造，脂肪酸的积累已经有了明显的提升，从而展示出其合成脂肪酸的应用潜力[34]。
近年来的研究，主要在代谢工程和合成生物学两方面来合成脂肪酸及优化脂肪酸产量。其中代谢工程主要是在脂肪酸代谢路径中调控基因的表达水平来实现的，有脂肪酸降解路径基因的敲除、前体旁路代谢路径基因的敲除、过表达脂肪酸合成路径基因的敲除及组合优化的方式。合成生物学主要通过动态调控回路、体外生物合成系统、功能逆转的β氧化循环及异源合成路径的整合来实现的[13]。其中，功能逆转的β氧化循环具有最高的合成效率。功能逆转的β氧化循环，不用乙酰CoA 到丙二酰CoA 的耗能转化而是直接利用乙酰CoA来使脂酰基链延长，从而在目标产物的合成过程中最优地利用碳源和能量 [25、27]，也就是将乙酰辅酶A作为前体物质进行脂肪酸的生物合成。同时由于II型CRISPR / Cas系统机制持续改进，造成CRISPR / Cas9为基础的新型可设计平台、天然Cas9核酸酶(Cas9)或Cas9 切口酶(Cas9n) 为基础的多位点靶向基因组编辑的实现，以及到目前为止Cas9工具被成功应用于不同的生物体并在无宿主依赖性情况下实现高效的多位点基因组编辑上显示出的可能性[812]。因此，我们应用基于Cas9系统工具来进行敲除大肠杆菌基因组上的5个基因序列，从而全面改造发酵菌株，干扰胞内乙酰辅酶A通向乙醇、丙酮酸等代谢途径，从而提高前体物质乙酰辅酶A的含量，来提高终产物中链脂肪酸的产量。
/
图1 基因敲除途径干扰示意图
微生物体内油脂的积累主要通过B氧化循环产生，该过程需要前体物质乙酰辅酶A，来产生最终产物中链脂肪酸，作为前体物质的乙酰辅酶A参与其它代谢途径，主要分解代谢通往醋酸发酵途径(pta和poxB)、乙醇(adhE),乳酸(ldhA)和琥珀酸(frdA)，基因敲除有关这几个方向的5个基因，可以干扰乙酰辅酶A的代谢，提高前体物质乙酰辅酶A的含量，来提升脂肪酸的终产量。
1 材料与方法
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1 材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1原料 4
1.1.2菌种培养、纯化用培养基4
1.1.3试剂盒和相关酶4
1.1.4主要仪器与设备4
1.2实验方法5
1.2.1基因敲除5
1.2.2菌株发酵 7
2 结果与分析 8
2.1 基因敲除菌株的获得8
2.1.1 pta基因的敲除 8
2.1.2 frdA基因的敲除9
2.1.3 poxB基因的敲除 11
2.1.4 adhE基因的敲除 12
2.1.5 ldhA、pta基因的敲除14
2.1.6 ldhA、pta、frdA基因的敲除15
2.1.7 ldhA、pta、frdA、poxB基因的敲除17
2.1.8 ldhA、pta、frdA、poxB、adhE基因的敲除18
2.2 脂肪酸产量验证20
3 讨论 21
致谢21
参考文献21
大肠杆菌胞内辅因子乙酰辅酶A的调控机制建立
引言
脂肪酸根据碳链的长短能分为短、中和长链脂肪酸三种，其中中链脂肪酸是指含612个碳原子的碳链的脂肪酸。天然油脂中 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
含有比较少的中链脂肪酸，在自然界中主要来自于母乳、牛奶及其制品、棕榈仁油和椰子油等。作为一种平台化合物的脂肪酸，在多个不同的领域内被普遍应用。烷/烯烃和脂肪酸酯这些衍生物与短链醇相比能量密度更高，而且与汽油相比没有10% ～ 20% 的混合壁垒，被认做是更有潜力的燃料替代品。而其衍生的脂肪醇和三酰甘油及其它衍生物的亲疏水性较为优良，是多种化工业品如洗涤剂、润滑剂、化妆品和药物等的主要原料。然而目前来看脂肪酸主要是从石油或动植物中提取，存在可持续性差等一系列问题，因而利用微生物高效地合成中链脂肪酸成为了近年来的研究热点[12].
肥胖会增加Ⅱ 型糖尿病、心血管疾病及某些癌症的发病率，显然已经成为人们日益关注的健康问题。尤其是从最近几年来看，与日俱增的肥胖的发病率，和饮食习惯和结构的变化有关系，更为重要的是由于过多地摄入含高热量的食物，如单糖类、饱和脂肪等，并且还和慵懒的生活习性有关[5]。因此，将膳食中脂肪酸的种类和组成进行调节显得尤为重要。近几年的研究显示，中链脂肪酸和长链脂肪酸相比具有消化吸收快、不形成脂肪积累等特点, 还具有减少脂肪堆积、改善胰岛素抵抗、调节能量代谢及抑制微生物等生物学功能，同时还具有抗菌、抗病毒、抗癌[18]、促进维生素吸收和降低炎性细胞因子产生的作用。在食品、医药、基因工程等营养相关方面有着广泛应用, 保健食品的开发和利用方面展现出巨大的潜力[1921]。同时由于MCFA或MCT 和长链脂肪酸(LCFA)或长链甘油三酯 (LCT)特殊的生理生化特性的不同,也可被用于人类的临床治疗(如胃肠炎、肥胖症、糖尿病), 或者用来为脂肪代谢障碍的患者和早产婴儿提供能量[2829]。MCFA 或MCT也可用于初生仔猪和鸡的饲养当中, 并已经对这方面做了一定基础的研究[2]。
自然界中的很多微生物，如霉菌、酵母菌、细菌等，能够在一定的条件下利用碳源合成并积累油脂。因为脂肪酸可以转化成多种食用油脂、生物能源、工业化学品，所以利用微生物来生产脂肪酸越来越被受到重视，并有望替代一部分植物油脂[67]。而大肠杆菌是作为一个生产脂肪酸具有吸引力的宿主生物，由于它的快速复制率、较高的生长速率，及可以生长在各种碳源中。除此大肠杆菌还拥有多种遗传操作工具用来改善菌株的性能和易高密度发酵等特性。也由于通过对大肠杆菌代谢工程的改造，脂肪酸的积累已经有了明显的提升，从而展示出其合成脂肪酸的应用潜力[34]。
近年来的研究，主要在代谢工程和合成生物学两方面来合成脂肪酸及优化脂肪酸产量。其中代谢工程主要是在脂肪酸代谢路径中调控基因的表达水平来实现的，有脂肪酸降解路径基因的敲除、前体旁路代谢路径基因的敲除、过表达脂肪酸合成路径基因的敲除及组合优化的方式。合成生物学主要通过动态调控回路、体外生物合成系统、功能逆转的β氧化循环及异源合成路径的整合来实现的[13]。其中，功能逆转的β氧化循环具有最高的合成效率。功能逆转的β氧化循环，不用乙酰CoA 到丙二酰CoA 的耗能转化而是直接利用乙酰CoA来使脂酰基链延长，从而在目标产物的合成过程中最优地利用碳源和能量 [25、27]，也就是将乙酰辅酶A作为前体物质进行脂肪酸的生物合成。同时由于II型CRISPR / Cas系统机制持续改进，造成CRISPR / Cas9为基础的新型可设计平台、天然Cas9核酸酶(Cas9)或Cas9 切口酶(Cas9n) 为基础的多位点靶向基因组编辑的实现，以及到目前为止Cas9工具被成功应用于不同的生物体并在无宿主依赖性情况下实现高效的多位点基因组编辑上显示出的可能性[812]。因此，我们应用基于Cas9系统工具来进行敲除大肠杆菌基因组上的5个基因序列，从而全面改造发酵菌株，干扰胞内乙酰辅酶A通向乙醇、丙酮酸等代谢途径，从而提高前体物质乙酰辅酶A的含量，来提高终产物中链脂肪酸的产量。
/
图1 基因敲除途径干扰示意图
微生物体内油脂的积累主要通过B氧化循环产生，该过程需要前体物质乙酰辅酶A，来产生最终产物中链脂肪酸，作为前体物质的乙酰辅酶A参与其它代谢途径，主要分解代谢通往醋酸发酵途径(pta和poxB)、乙醇(adhE),乳酸(ldhA)和琥珀酸(frdA)，基因敲除有关这几个方向的5个基因，可以干扰乙酰辅酶A的代谢，提高前体物质乙酰辅酶A的含量，来提升脂肪酸的终产量。
1 材料与方法
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/spkxygc/273.html
