新的己糖激酶的开发新型耐盐以及耐高温己糖激酶的发现和特性研究
新的己糖激酶的开发新型耐盐以及耐高温己糖激酶的发现和特性研究[20200509182634]
摘要：糖类是自然界广泛存在的重要的生物分子，它们通常以多种形式存在, 包括单糖、寡糖和多糖。核苷酸糖是单糖的活化形式，是生物体合成糖链和糖缀合物必需的前体,高效地制备天然和非天然的核苷酸糖对生物化学及药物化学研究意义重大。但是目前市面上的核苷酸糖价格较高，因此研究核苷酸糖的低成本的生物合成方法成为必需。核苷酸糖的制备第一步最重要的是获得磷酸化的单糖，利用己糖激酶可以实现这一步,因此研究各类己糖激酶的结构与功能十分重要，而研究一些能在极端条件下（如高温和高盐）仍能保持活性的己糖激酶对其在工业上的应用尤为重要。本实验旨在通过构建源自嗜热菌和耐盐菌的己糖激酶基因克隆载体和表达载体，最终表达出具有耐热或耐盐特性的己糖激酶。
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关键字:糖类；核苷酸糖；己糖激酶；基因克隆；异源性表达
目录
摘要 0
关键词 0
Abstract 1
Key words 1
1绪论 1
1.1 糖链的合成-化学法和酶法 2
1.2 核苷酸糖供体及其生物合成 3
1.3 糖激酶 5
1.3.1 糖激酶的应用发展 5
1.3.2 己糖激酶的结构与功能 5
2 实验材料与方法 6
2.1 实验材料和仪器 6
2.1.1 菌株和质粒 6
2.1.2 主要工具酶和试剂 7
2.1.3 实验仪器 7
2.1.4 LB 培养基 8
2.1.5 SDS- PAGE 缓冲液的配制 8
2.2 实验方法 8
2.2.1 嗜热己糖激酶基因TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和耐盐己糖激酶基因HwHexK_01的扩增 8
2.2.2嗜热己糖激酶基因TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和耐盐己糖激酶基因HwHexK_01的 PCR 扩增产物的回收 9
2.2.3 pGH Blunt end PCR产物亚克隆系统的构建 10
2.2.4 感受态大肠杆菌 TOP10 的制备 10
2.2.5 连接产物的转化 10
2.2.6 阳性亚克隆的筛选鉴定-挑斑检测 10
2.2.7 提取质粒与 pET 28a或pET 30a 克隆载体的连接 11
2.2.8 连接产物的转化 11
2.2.9 阳性克隆的筛选鉴定-挑斑检测 11
2.2.10嗜热己糖激酶基因TaTsHexK_0638、TaT *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
sHexK_1642和耐盐己糖激酶基因HwHexK_01基因片段在大肠杆菌中的诱导表达 12
2.2.11 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642粗酶液制备和热纯化 12
2.2.12 HwHexK_1己糖激酶的镍离子亲和层析柱纯化 12
2.2.13 表达产物TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01的SDS-PAGE分析 12
2.2.14 表达产物TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01的酶学活性的测定 13
3 实验结果 14
3.1 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01 基因的克隆与重组表达载体的构建 14
3.1.1 TaTsHexK_0638的克隆与重组表达载体的构建 14
3.1.2 TaTsHexK_1642基因的克隆与重组表达载体的构建 15
3.2 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01的表达和热处理纯化 16
3.3 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01活性测定-HPLC 17
4 展望 18
致谢 19
参考文献： 19
新的己糖激酶的开发---新型耐盐以及耐高温己糖激酶的发现和特性研究
引言
1绪论
糖类（carbohydrate或glycan，包括单糖、寡糖和多糖）是自然界中存在最为广泛的（从低等细菌到高等动植物）的生物大分子。它们通常以相互间的同聚物或杂聚物形式存在，或者与各种各样的脂或蛋白相结合，糖分子结构的多样性直接关系到它们广泛的生物活性。糖类不仅可以储存能量，而且在生物识别和附着过程中也起到重要作用。Sharon等人就曾撰文指出决定很多天然多聚物特性的并不是氨基酸或核苷酸而是糖残基[1]。糖类参与精子与卵子的结合[2]，胚胎发育中的细胞分化[3]以及抗原的产生[4]，此外，寄生性病毒、细菌和毒素总是先利用各种细胞表面的糖而紧紧地附着在细胞表面，然后再进入细胞进而破坏细胞。同样，恶性、迁移性细胞能专一地识别细胞表面的糖而实现其转移和增殖。因而糖类和它们的类似物也被看作一类潜在的药物[5]。近年来这方面的研究已进入到白血球与流感病毒的牯合和异体移植领域。生物活性糖类的大量制备是现代医学中糖类应用和研究的前提条件。DNA和多肽两类生物大分子目前已经有商业化仪器进行固相合成。由于糖类结构的复杂性，使用相应的方法进行糖的合成还处于探索阶段。
核苷酸糖是单糖的异头碳与核苷二磷酸或核苷一磷酸连接形成的衍生物，是单糖的活化形式。核苷酸糖作为糖基转移酶催化的转糖基反应的糖基供体，是生物体合成糖链和糖缀合物必需的前体；天然核苷酸糖的结构类似物还可能作为酶的抑制剂或作为研究分析糖缀合物生物合成途径的工具。因此，高效地制备天然和非天然的核苷酸糖对生物化学及药物化学研究意义重大。生物体内核苷酸糖的补救合成（Salvage patHwHexKay）途径步骤少，操作简单，是酶法合成核苷酸糖常用的合成路线。补救合成途径在体内有着重要的生理意义，它以细胞内多糖、糖蛋白或者糖脂降解后释放的单糖为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
底物，经过中间产物糖-1-磷酸最终合成UDP-糖或GDP-糖，如UDP-Gal，UDP-GlcA和UDP-GalNAc等，补救合成途径的存在使体内的资源得到充分利用，是一种生物进化的表现，也为高效地制备天然和非天然的核苷酸糖的实现提供了一条可靠的途径。
核苷酸糖的制备第一步最重要的是获得磷酸化的单糖，对于不同的单糖,第一步的磷酸化过程会有不同的产物，如甘露糖和葡萄糖都会分别磷酸化成为6-磷酸甘露糖、6-磷酸葡萄糖。而单糖的磷酸化过程都是由糖激酶催化的，例如甘露糖激酶和葡萄糖激酶。广义的己糖激酶通常会表现出较为广的底物专一性，而其他非己糖激酶对其各自的糖底物有较窄的底物专一性。这些磷酸化过程所需要的己糖激酶，根据氨基酸序列的相似性，被归类为ROK（属细菌阻遏蛋白，未知的可读框，糖激酶）家族酶类[6]。和ROK家族酶类一样，广义的已糖激酶同样也含特征序列（[L/I/V/M]X2G[L/I/V/M/F/C/T]GX[G/A][L/I/V/M/F/A]X8GX3-5[G/A/T/P]X2G[R/K/H]共有序列1）[7]和一个基础序列CXCGX2GCXE（共有序列2）[8]。在酶学方面，从嗜热菌中获得的己糖激酶包括Thermotogamaritima中的葡萄糖激酶,AeropyrumPernix、Thermoproteustenax和Thermuscaldophilus中的狭义的己糖激酶。同时Streptomyces griseus中的葡萄糖激酶的三维结构也已经为人所知。但是总体来说，嗜热性细菌中的己糖激酶的结构还未完全为人所知。在制备核苷酸糖的过程中使用此类能够在极端条件下仍然保持活性的糖激酶对生物合成大批量核苷酸糖有着重大的意义。
1.1 糖链的合成-化学法和酶法
研究糖链的生物功能，就要获得结构均一且明确的含糖化合物。由于从生物来源分离的糖或糖缀合物的糖链结构具有微不均一性，化学合成操作复杂、收率比较低，因此人工合成目的糖链就成为不可替代的选择。体外寡糖合成有两种常用方法：化学合成和酶法（包括化学-酶法）合成。化学合成能够得到结构均一的寡糖分子，合成非天然糖方面具有优势，可使其带有易于进一步标记的基团，促进对糖类代谢的研究; 也可以为天然化合物提供结构多样的衍生物，为药物开发提供更多可能的靶标. 然而由于糖类本身结构的复杂性和化学方法的低化学、立体结构选择性，该方法往往需要繁琐的保护／脱保护步骤，大大降低产量。而生物体内糖链合成途径中的糖基转移酶可以高效合成区位特异性和立体特异性的糖苷键，所以用糖基转移酶（主要是Leloir型糖基转移酶）合成结构均一的糖链，酶催化的反应则具有高度的化学、立体结构选择性, 能够克服化学合成中存在的问题[9-10]，在某种程度上已成为有机化学合成糖链的有效互补途径。。将化学合成的灵活性与酶法合成的高效高特异性结合（即化学酶法合成），就有可能实现糖及其结构类似物的高效合成，是近年来广泛应用于糖生物学研究领域的重要手段。表1给出了化学合成和酶法合成的优缺点比较。
摘要：糖类是自然界广泛存在的重要的生物分子，它们通常以多种形式存在, 包括单糖、寡糖和多糖。核苷酸糖是单糖的活化形式，是生物体合成糖链和糖缀合物必需的前体,高效地制备天然和非天然的核苷酸糖对生物化学及药物化学研究意义重大。但是目前市面上的核苷酸糖价格较高，因此研究核苷酸糖的低成本的生物合成方法成为必需。核苷酸糖的制备第一步最重要的是获得磷酸化的单糖，利用己糖激酶可以实现这一步,因此研究各类己糖激酶的结构与功能十分重要，而研究一些能在极端条件下（如高温和高盐）仍能保持活性的己糖激酶对其在工业上的应用尤为重要。本实验旨在通过构建源自嗜热菌和耐盐菌的己糖激酶基因克隆载体和表达载体，最终表达出具有耐热或耐盐特性的己糖激酶。
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关键字:糖类；核苷酸糖；己糖激酶；基因克隆；异源性表达
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摘要 0
关键词 0
Abstract 1
Key words 1
1绪论 1
1.1 糖链的合成-化学法和酶法 2
1.2 核苷酸糖供体及其生物合成 3
1.3 糖激酶 5
1.3.1 糖激酶的应用发展 5
1.3.2 己糖激酶的结构与功能 5
2 实验材料与方法 6
2.1 实验材料和仪器 6
2.1.1 菌株和质粒 6
2.1.2 主要工具酶和试剂 7
2.1.3 实验仪器 7
2.1.4 LB 培养基 8
2.1.5 SDS- PAGE 缓冲液的配制 8
2.2 实验方法 8
2.2.1 嗜热己糖激酶基因TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和耐盐己糖激酶基因HwHexK_01的扩增 8
2.2.2嗜热己糖激酶基因TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和耐盐己糖激酶基因HwHexK_01的 PCR 扩增产物的回收 9
2.2.3 pGH Blunt end PCR产物亚克隆系统的构建 10
2.2.4 感受态大肠杆菌 TOP10 的制备 10
2.2.5 连接产物的转化 10
2.2.6 阳性亚克隆的筛选鉴定-挑斑检测 10
2.2.7 提取质粒与 pET 28a或pET 30a 克隆载体的连接 11
2.2.8 连接产物的转化 11
2.2.9 阳性克隆的筛选鉴定-挑斑检测 11
2.2.10嗜热己糖激酶基因TaTsHexK_0638、TaT *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
sHexK_1642和耐盐己糖激酶基因HwHexK_01基因片段在大肠杆菌中的诱导表达 12
2.2.11 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642粗酶液制备和热纯化 12
2.2.12 HwHexK_1己糖激酶的镍离子亲和层析柱纯化 12
2.2.13 表达产物TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01的SDS-PAGE分析 12
2.2.14 表达产物TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01的酶学活性的测定 13
3 实验结果 14
3.1 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01 基因的克隆与重组表达载体的构建 14
3.1.1 TaTsHexK_0638的克隆与重组表达载体的构建 14
3.1.2 TaTsHexK_1642基因的克隆与重组表达载体的构建 15
3.2 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01的表达和热处理纯化 16
3.3 TaTsHexK_0638、TaTsHexK_1642和HwHexK_01活性测定-HPLC 17
4 展望 18
致谢 19
参考文献： 19
新的己糖激酶的开发---新型耐盐以及耐高温己糖激酶的发现和特性研究
引言
1绪论
糖类（carbohydrate或glycan，包括单糖、寡糖和多糖）是自然界中存在最为广泛的（从低等细菌到高等动植物）的生物大分子。它们通常以相互间的同聚物或杂聚物形式存在，或者与各种各样的脂或蛋白相结合，糖分子结构的多样性直接关系到它们广泛的生物活性。糖类不仅可以储存能量，而且在生物识别和附着过程中也起到重要作用。Sharon等人就曾撰文指出决定很多天然多聚物特性的并不是氨基酸或核苷酸而是糖残基[1]。糖类参与精子与卵子的结合[2]，胚胎发育中的细胞分化[3]以及抗原的产生[4]，此外，寄生性病毒、细菌和毒素总是先利用各种细胞表面的糖而紧紧地附着在细胞表面，然后再进入细胞进而破坏细胞。同样，恶性、迁移性细胞能专一地识别细胞表面的糖而实现其转移和增殖。因而糖类和它们的类似物也被看作一类潜在的药物[5]。近年来这方面的研究已进入到白血球与流感病毒的牯合和异体移植领域。生物活性糖类的大量制备是现代医学中糖类应用和研究的前提条件。DNA和多肽两类生物大分子目前已经有商业化仪器进行固相合成。由于糖类结构的复杂性，使用相应的方法进行糖的合成还处于探索阶段。
核苷酸糖是单糖的异头碳与核苷二磷酸或核苷一磷酸连接形成的衍生物，是单糖的活化形式。核苷酸糖作为糖基转移酶催化的转糖基反应的糖基供体，是生物体合成糖链和糖缀合物必需的前体；天然核苷酸糖的结构类似物还可能作为酶的抑制剂或作为研究分析糖缀合物生物合成途径的工具。因此，高效地制备天然和非天然的核苷酸糖对生物化学及药物化学研究意义重大。生物体内核苷酸糖的补救合成（Salvage patHwHexKay）途径步骤少，操作简单，是酶法合成核苷酸糖常用的合成路线。补救合成途径在体内有着重要的生理意义，它以细胞内多糖、糖蛋白或者糖脂降解后释放的单糖为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
底物，经过中间产物糖-1-磷酸最终合成UDP-糖或GDP-糖，如UDP-Gal，UDP-GlcA和UDP-GalNAc等，补救合成途径的存在使体内的资源得到充分利用，是一种生物进化的表现，也为高效地制备天然和非天然的核苷酸糖的实现提供了一条可靠的途径。
核苷酸糖的制备第一步最重要的是获得磷酸化的单糖，对于不同的单糖,第一步的磷酸化过程会有不同的产物，如甘露糖和葡萄糖都会分别磷酸化成为6-磷酸甘露糖、6-磷酸葡萄糖。而单糖的磷酸化过程都是由糖激酶催化的，例如甘露糖激酶和葡萄糖激酶。广义的己糖激酶通常会表现出较为广的底物专一性，而其他非己糖激酶对其各自的糖底物有较窄的底物专一性。这些磷酸化过程所需要的己糖激酶，根据氨基酸序列的相似性，被归类为ROK（属细菌阻遏蛋白，未知的可读框，糖激酶）家族酶类[6]。和ROK家族酶类一样，广义的已糖激酶同样也含特征序列（[L/I/V/M]X2G[L/I/V/M/F/C/T]GX[G/A][L/I/V/M/F/A]X8GX3-5[G/A/T/P]X2G[R/K/H]共有序列1）[7]和一个基础序列CXCGX2GCXE（共有序列2）[8]。在酶学方面，从嗜热菌中获得的己糖激酶包括Thermotogamaritima中的葡萄糖激酶,AeropyrumPernix、Thermoproteustenax和Thermuscaldophilus中的狭义的己糖激酶。同时Streptomyces griseus中的葡萄糖激酶的三维结构也已经为人所知。但是总体来说，嗜热性细菌中的己糖激酶的结构还未完全为人所知。在制备核苷酸糖的过程中使用此类能够在极端条件下仍然保持活性的糖激酶对生物合成大批量核苷酸糖有着重大的意义。
1.1 糖链的合成-化学法和酶法
研究糖链的生物功能，就要获得结构均一且明确的含糖化合物。由于从生物来源分离的糖或糖缀合物的糖链结构具有微不均一性，化学合成操作复杂、收率比较低，因此人工合成目的糖链就成为不可替代的选择。体外寡糖合成有两种常用方法：化学合成和酶法（包括化学-酶法）合成。化学合成能够得到结构均一的寡糖分子，合成非天然糖方面具有优势，可使其带有易于进一步标记的基团，促进对糖类代谢的研究; 也可以为天然化合物提供结构多样的衍生物，为药物开发提供更多可能的靶标. 然而由于糖类本身结构的复杂性和化学方法的低化学、立体结构选择性，该方法往往需要繁琐的保护／脱保护步骤，大大降低产量。而生物体内糖链合成途径中的糖基转移酶可以高效合成区位特异性和立体特异性的糖苷键，所以用糖基转移酶（主要是Leloir型糖基转移酶）合成结构均一的糖链，酶催化的反应则具有高度的化学、立体结构选择性, 能够克服化学合成中存在的问题[9-10]，在某种程度上已成为有机化学合成糖链的有效互补途径。。将化学合成的灵活性与酶法合成的高效高特异性结合（即化学酶法合成），就有可能实现糖及其结构类似物的高效合成，是近年来广泛应用于糖生物学研究领域的重要手段。表1给出了化学合成和酶法合成的优缺点比较。
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