血红蛋白在Co3O4纳米材料上的固定及生物传感器研究
血红蛋白在Co3O4纳米材料上的固定及生物传感器研究[20200412222955]
摘 要
本实验研究了吸附在Co3O4纳米和二甲亚砜(DMSO)修饰的石墨电极 (GE) 上的血红蛋白(Hb)的电催化性能和血红蛋白(Hb)的直接伏安法。血红蛋修饰的电极在0.1 M的pH=7.0的PBS缓冲溶液测得有很好的氧化还原峰的循环伏安曲线，可得出电子修饰在电极上的血红蛋白与石墨电极本身间有直接转移的结论，并且经计算得出修饰电极的电子转移速率常数为2.6964s-1，表面覆盖量г=7.348×10-10 mol/cm2，式量电位为-0.359V(vs.SCE)。通过红外和紫外光谱分析实验研究表明在Hb/Co3O4/DMSO膜中，血红蛋白本身的活性和结构没有被影响和破坏。通过电化学阻抗实验进一步研究了修饰电极的表面性质。温度对修饰电极影响的实验测出这一修饰电极在75℃还能正常工作，修饰电极对过氧化氢溶液的电催化实验，得出此修饰电极对过氧化氢有很好的催化效果，并通过修饰电极对过氧化氢的计时电流实验得出还原性电催化响应电流与过氧化氢的浓度呈现出线性关系，线性范围0.01到0.85mM，通过计算得出对过氧化氢溶液的检测限在1.89×10-3mM，修饰电极对过氧化氢的表观米氏常数为0.363 mM，修饰电极对过氧化氢的灵敏度为467mA/M·cm-2，结果表明基于血红蛋白直接电化学的新一代生物传感器有很好的应用空间。
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关键字:血红蛋白直接电化学生物传感器过氧化氢Co3O4纳米粒子
目录
1.引言 1
2.实验部分 4
2.1 试剂与材料 4
2.2 电极制备 4
2.2.1 打磨电极 4
2.2.2 配制溶液 4
2.2.3 制备六种电极 5
2.3测试方法 5
3.结果与讨论 7
3.1 Hb/Co3O4/DMSO膜的光谱分析 7
3.2 Hb/Co3O4/DMSO/GE修饰电极的直接电化学行为 8
3.3 pH值对Hb/Co3O4/DMSO/GE直接电子传递的影响 13
3.4 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极的交流阻抗实验 13
3.5 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极对H2O2和苯酚的催化 14
3.6 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极的热力学稳定性 17
3.7 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极的重复性 18
结论 19
参考文献 20
致谢 23
1.引言
电化学分析法是仪器分析的重要组成部分之一，它是一种对电化学和电学性质的材料进行表征与测量的方法，它主要作用是对物质的组成和形态分析。随着科技的发展电化学分析法对电极过程的理论研究和信息科学、生命科学、环境科学的发展也具有重要的作用。而生物传感器的出现对分析化学做出了极大的的贡献，特别是促进了电化学分析的发展与进步。
随着近几十年科学技术的不断发展进步，一种新传感技术生物传感器得以出现并且快速的发展起来。生物传感器研究是一个有多学科相互渗透而形成的领域，包括生物、医学、化学、物理、电子技术等[1]。生物传感器是一种新型器材，主要功能是用于快速检测物体中各种物理、化学、生物的含量，它的敏感材料主要是由固定化的生物成分或者生物体本身来担当，并且这些敏感材料最后要和合适的化学换能器相结合。它捕捉目标与敏感基元之间的反应，是通过各种信号转换器来实现的，如：物理、化学型转换器，而后将反应的进展程度表达出来是用各种电学信号，通常是分散或连续的，最终得出被测物的浓度[2]。近年来，生物化学和生物传感器快速的发展特别是其中的电化学和光化学纳米传感器的研究进展，为它们的研究提供了新的有效的工具，于是大大的促进了一些领域研究的发展，特别是生物与医学领域。电化学这类的传感器的性能是比较良好，比如灵敏度高、专一性高、成本低、反应迅速、操作简单、样品的用量少等，已经在很多领域展现出了广阔的应用前景，比如：食品检测、环境监测、生物医学等[3]。
酶传感器是生物传感器发展一种变革，酶传感器的出现大大的促进了生物传感器的发展，因此在生物传感器发展领域中酶传感器的作用是十分显著的。酶生物传感器通常是由生物敏感膜和与换能系统组成的, 而后再通过一系类方法把酶和传感器最终结合在一起，正因为此种组合让酶传感器既有使固定的酶有比较难溶的特点, 同时又有比较高的高灵敏度；酶的专一性, 使酶生物传感器又具有选择性高的优点, 凭借着这些优点酶生物传感器能够直接对比较的复杂试样进行比较精确的测定[4]。而单单酶本身一般都溶于水的特性，导致酶本身也不太稳定，这就需要通过其他的办法来延长生物活性物质的活性，将酶固定在各种载体上，是一种比较有效的延长生物活性物质的活性的方法。因此固定化技术的进步成为决定着生物传感器的选择性、稳定性、灵敏度、使用寿命和检测范围等性能的关键。传统的酶固定化方法主要有四种：包埋法、吸附法、共价键合法与交联法[5]。伴随着广大科技学者的不懈努力，我国在酶传感器研究领域已取得了举世瞩目的成就，主要成功体现在表现在防止酶的流失与电子媒介体；提高固定化酶活力的技术；各种高新技术在酶传感器中的应用与载体选择范围扩大等方面[6]。因此，适当的将蛋白质固定在电极表面的的使用方法，成为了当前蛋白质电化学研究的热点。比如：葡萄糖氧化酶(GOD)[11];辣根过氧化物酶(HRP)[7];肌红蛋白(Mb)[8,9]、血红蛋白(Hb)[10];细胞色素P450(CytP450)等的研究。
血红蛋白(Hb)是以血红素为辅基并且使血液呈现出红色的生物蛋白质，它的主要功能是在生物体中运输氧气和二氧化碳。血红蛋白(Hb)是生命活动中很重要的物质基础，是它维持了生物体内的酸碱平衡。血红蛋白分子是由四个肽链和血红素辅基组成，其中血红素辅基则是由原卟啉环与存在其中的亚铁原子组成[12]。近些年来，伴随着科学家对Hb的研究不断深入，人们对血红蛋白的生理功能和结构研究的比较清楚，并且因为血红蛋白取材方便、价格相对较低廉，所以研究者将Hb作为研究蛋白质和酶直接电子转移的理想模型。虽然血红蛋白具有电活性中心，但是因为Hb空间结构复杂，分子量庞大，并且它的电活性中心血红素被肽链包围而不易与外界接触，换句话来说，由于血红蛋白的强烈吸附作用会使得玻碳电极表面被钝化，导致Hb与电极间的电子交换会很难，电流效应比较低，这就需要借助媒介体 、促进剂或特殊电极材料促进电化学反应。
因为血红蛋白和电极表面的直接电子转移比较困难，所以科学家们不断地探索合适的材料来实现血红蛋白在电极表面的直接电子转移，包括有模拟生物膜、纳米材料、无机多孔材料、稀土氧化物与生物大分子，比如LB膜[13]，硫化铜微球，二氧化铈[14]，色氨酸[15]。这其中由于纳米材料具有非常特殊的化学和物理性质，它很久以前就引起了研究者的广泛关注[16]。纳米材料颗粒的尺寸一般在1-100nm，因为它的表面自由能高、比表面积大、吸附性强、宏观隧道效应与导电效应好等优点，成为了研究热门。金属纳米粒子的各种性质大都和它的颗粒大小有着很大的关系，金属纳米粒子的这种特殊性质使它具有了很多额外体积效应 、量子尺寸效应等，正是这些效应使得纳米级材料具有不同于相应非纳米材料的各种性能，如磁学、电学、光学和催化性能等，这些特殊的性能让金属纳米材料逐渐成为电分析化学领域研究的重点[17]。现在用到的纳米材料有纳米硫化镉[18]、二氧化硅纳米粒子[19]、锰纳米粒子[20]等。本实验用的纳米材料是四氧化三钴纳米粒子，四氧化三钴纳米粒与四氧化三铁为异质同晶，是一种重要的磁性P型半导体，在锂电池、超级电容、气体传感器与催化剂等很多领域中都有广泛应用。Zhang等研究了Co3O4 纳米粒子的过氧化物模拟酶和过氧化氢模拟酶的双酶活性。他们利用电化学的方法证明了Co3O4纳米颗粒修饰的过氧化物模拟酶在对过氧化氢的催化机理源于Co3O4 纳米颗粒对反应底物H2O2 和四甲基联苯胺(TMB)之间的电子转移的促进。不是四氧化三钴纳米粒子催化过氧化氢产生的羟基自由基氧化底物TMB[21]。
循环伏安法是研究电化学的一种常用方法，因为在一次三角波扫描中，完成一个还原和氧化过程的循环，所以被称为循环伏安法。因其具有分析时间短、灵敏度高、环保等优点，迅速发展成新兴的的分析方法，用来研究电极吸附现象、各类物质氧化还原机理、电极可逆的判断等。
本论文是将血红蛋白混合在以二甲亚砜溶剂的纳米级四氧化三钴的悬浮液中，再将此混合物在漩涡混合仪器上摇匀后滴涂在已经打磨得呈光滑镜面的石墨电极表面用来固定血红蛋白分子，以此研究血红蛋白酶在纳米四氧化三钴材料修饰电极上的直接电化学行为，本实验研究了血红蛋白固定在Co3O4纳米粒子和二甲亚砜(DMSO)修饰的石墨电极上的直接电化学行为，继而探索血红蛋白与四氧化三钴纳米粒子修饰电极对双氧水的电催化。
2. 实验部分
摘 要
本实验研究了吸附在Co3O4纳米和二甲亚砜(DMSO)修饰的石墨电极 (GE) 上的血红蛋白(Hb)的电催化性能和血红蛋白(Hb)的直接伏安法。血红蛋修饰的电极在0.1 M的pH=7.0的PBS缓冲溶液测得有很好的氧化还原峰的循环伏安曲线，可得出电子修饰在电极上的血红蛋白与石墨电极本身间有直接转移的结论，并且经计算得出修饰电极的电子转移速率常数为2.6964s-1，表面覆盖量г=7.348×10-10 mol/cm2，式量电位为-0.359V(vs.SCE)。通过红外和紫外光谱分析实验研究表明在Hb/Co3O4/DMSO膜中，血红蛋白本身的活性和结构没有被影响和破坏。通过电化学阻抗实验进一步研究了修饰电极的表面性质。温度对修饰电极影响的实验测出这一修饰电极在75℃还能正常工作，修饰电极对过氧化氢溶液的电催化实验，得出此修饰电极对过氧化氢有很好的催化效果，并通过修饰电极对过氧化氢的计时电流实验得出还原性电催化响应电流与过氧化氢的浓度呈现出线性关系，线性范围0.01到0.85mM，通过计算得出对过氧化氢溶液的检测限在1.89×10-3mM，修饰电极对过氧化氢的表观米氏常数为0.363 mM，修饰电极对过氧化氢的灵敏度为467mA/M·cm-2，结果表明基于血红蛋白直接电化学的新一代生物传感器有很好的应用空间。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:血红蛋白直接电化学生物传感器过氧化氢Co3O4纳米粒子
目录
1.引言 1
2.实验部分 4
2.1 试剂与材料 4
2.2 电极制备 4
2.2.1 打磨电极 4
2.2.2 配制溶液 4
2.2.3 制备六种电极 5
2.3测试方法 5
3.结果与讨论 7
3.1 Hb/Co3O4/DMSO膜的光谱分析 7
3.2 Hb/Co3O4/DMSO/GE修饰电极的直接电化学行为 8
3.3 pH值对Hb/Co3O4/DMSO/GE直接电子传递的影响 13
3.4 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极的交流阻抗实验 13
3.5 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极对H2O2和苯酚的催化 14
3.6 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极的热力学稳定性 17
3.7 Hb/Co3O4/DMSO/GE电极的重复性 18
结论 19
参考文献 20
致谢 23
1.引言
电化学分析法是仪器分析的重要组成部分之一，它是一种对电化学和电学性质的材料进行表征与测量的方法，它主要作用是对物质的组成和形态分析。随着科技的发展电化学分析法对电极过程的理论研究和信息科学、生命科学、环境科学的发展也具有重要的作用。而生物传感器的出现对分析化学做出了极大的的贡献，特别是促进了电化学分析的发展与进步。
随着近几十年科学技术的不断发展进步，一种新传感技术生物传感器得以出现并且快速的发展起来。生物传感器研究是一个有多学科相互渗透而形成的领域，包括生物、医学、化学、物理、电子技术等[1]。生物传感器是一种新型器材，主要功能是用于快速检测物体中各种物理、化学、生物的含量，它的敏感材料主要是由固定化的生物成分或者生物体本身来担当，并且这些敏感材料最后要和合适的化学换能器相结合。它捕捉目标与敏感基元之间的反应，是通过各种信号转换器来实现的，如：物理、化学型转换器，而后将反应的进展程度表达出来是用各种电学信号，通常是分散或连续的，最终得出被测物的浓度[2]。近年来，生物化学和生物传感器快速的发展特别是其中的电化学和光化学纳米传感器的研究进展，为它们的研究提供了新的有效的工具，于是大大的促进了一些领域研究的发展，特别是生物与医学领域。电化学这类的传感器的性能是比较良好，比如灵敏度高、专一性高、成本低、反应迅速、操作简单、样品的用量少等，已经在很多领域展现出了广阔的应用前景，比如：食品检测、环境监测、生物医学等[3]。
酶传感器是生物传感器发展一种变革，酶传感器的出现大大的促进了生物传感器的发展，因此在生物传感器发展领域中酶传感器的作用是十分显著的。酶生物传感器通常是由生物敏感膜和与换能系统组成的, 而后再通过一系类方法把酶和传感器最终结合在一起，正因为此种组合让酶传感器既有使固定的酶有比较难溶的特点, 同时又有比较高的高灵敏度；酶的专一性, 使酶生物传感器又具有选择性高的优点, 凭借着这些优点酶生物传感器能够直接对比较的复杂试样进行比较精确的测定[4]。而单单酶本身一般都溶于水的特性，导致酶本身也不太稳定，这就需要通过其他的办法来延长生物活性物质的活性，将酶固定在各种载体上，是一种比较有效的延长生物活性物质的活性的方法。因此固定化技术的进步成为决定着生物传感器的选择性、稳定性、灵敏度、使用寿命和检测范围等性能的关键。传统的酶固定化方法主要有四种：包埋法、吸附法、共价键合法与交联法[5]。伴随着广大科技学者的不懈努力，我国在酶传感器研究领域已取得了举世瞩目的成就，主要成功体现在表现在防止酶的流失与电子媒介体；提高固定化酶活力的技术；各种高新技术在酶传感器中的应用与载体选择范围扩大等方面[6]。因此，适当的将蛋白质固定在电极表面的的使用方法，成为了当前蛋白质电化学研究的热点。比如：葡萄糖氧化酶(GOD)[11];辣根过氧化物酶(HRP)[7];肌红蛋白(Mb)[8,9]、血红蛋白(Hb)[10];细胞色素P450(CytP450)等的研究。
血红蛋白(Hb)是以血红素为辅基并且使血液呈现出红色的生物蛋白质，它的主要功能是在生物体中运输氧气和二氧化碳。血红蛋白(Hb)是生命活动中很重要的物质基础，是它维持了生物体内的酸碱平衡。血红蛋白分子是由四个肽链和血红素辅基组成，其中血红素辅基则是由原卟啉环与存在其中的亚铁原子组成[12]。近些年来，伴随着科学家对Hb的研究不断深入，人们对血红蛋白的生理功能和结构研究的比较清楚，并且因为血红蛋白取材方便、价格相对较低廉，所以研究者将Hb作为研究蛋白质和酶直接电子转移的理想模型。虽然血红蛋白具有电活性中心，但是因为Hb空间结构复杂，分子量庞大，并且它的电活性中心血红素被肽链包围而不易与外界接触，换句话来说，由于血红蛋白的强烈吸附作用会使得玻碳电极表面被钝化，导致Hb与电极间的电子交换会很难，电流效应比较低，这就需要借助媒介体 、促进剂或特殊电极材料促进电化学反应。
因为血红蛋白和电极表面的直接电子转移比较困难，所以科学家们不断地探索合适的材料来实现血红蛋白在电极表面的直接电子转移，包括有模拟生物膜、纳米材料、无机多孔材料、稀土氧化物与生物大分子，比如LB膜[13]，硫化铜微球，二氧化铈[14]，色氨酸[15]。这其中由于纳米材料具有非常特殊的化学和物理性质，它很久以前就引起了研究者的广泛关注[16]。纳米材料颗粒的尺寸一般在1-100nm，因为它的表面自由能高、比表面积大、吸附性强、宏观隧道效应与导电效应好等优点，成为了研究热门。金属纳米粒子的各种性质大都和它的颗粒大小有着很大的关系，金属纳米粒子的这种特殊性质使它具有了很多额外体积效应 、量子尺寸效应等，正是这些效应使得纳米级材料具有不同于相应非纳米材料的各种性能，如磁学、电学、光学和催化性能等，这些特殊的性能让金属纳米材料逐渐成为电分析化学领域研究的重点[17]。现在用到的纳米材料有纳米硫化镉[18]、二氧化硅纳米粒子[19]、锰纳米粒子[20]等。本实验用的纳米材料是四氧化三钴纳米粒子，四氧化三钴纳米粒与四氧化三铁为异质同晶，是一种重要的磁性P型半导体，在锂电池、超级电容、气体传感器与催化剂等很多领域中都有广泛应用。Zhang等研究了Co3O4 纳米粒子的过氧化物模拟酶和过氧化氢模拟酶的双酶活性。他们利用电化学的方法证明了Co3O4纳米颗粒修饰的过氧化物模拟酶在对过氧化氢的催化机理源于Co3O4 纳米颗粒对反应底物H2O2 和四甲基联苯胺(TMB)之间的电子转移的促进。不是四氧化三钴纳米粒子催化过氧化氢产生的羟基自由基氧化底物TMB[21]。
循环伏安法是研究电化学的一种常用方法，因为在一次三角波扫描中，完成一个还原和氧化过程的循环，所以被称为循环伏安法。因其具有分析时间短、灵敏度高、环保等优点，迅速发展成新兴的的分析方法，用来研究电极吸附现象、各类物质氧化还原机理、电极可逆的判断等。
本论文是将血红蛋白混合在以二甲亚砜溶剂的纳米级四氧化三钴的悬浮液中，再将此混合物在漩涡混合仪器上摇匀后滴涂在已经打磨得呈光滑镜面的石墨电极表面用来固定血红蛋白分子，以此研究血红蛋白酶在纳米四氧化三钴材料修饰电极上的直接电化学行为，本实验研究了血红蛋白固定在Co3O4纳米粒子和二甲亚砜(DMSO)修饰的石墨电极上的直接电化学行为，继而探索血红蛋白与四氧化三钴纳米粒子修饰电极对双氧水的电催化。
2. 实验部分
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