花烛aadfr基因对矮牵牛的遗传转化研究
摘要：由于矮牵牛离体再生容易，遗传背景清楚，且花器官较大，已成为植物遗传转化研究的模式植物。可以为花色分析提供理想的遗传体系，可以用于影响花色形成关键基因的功能分析。为了探讨单子叶植物花烛中的DFR基因能否在双子叶植物矮牵牛中表达，以研究其对矮牵牛花色改变的影响，本试验采用RT-PCR技术克隆了花烛AaDFR基因，并构建载体转化矮牵牛，通过对多个矮牵牛株系进行转化，获得了3个转化植株，PCR初步鉴定表明外源基因已转入矮牵牛。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.2 主要试剂 2
1.3 试验方法 3
1.3.1 总RNA提取与质量检测3
1.3.2 cDNA的合成3
1.3.3 AaDFR基因ORF扩增3
1.3.4 提取质粒4
1.3.5 AaDFR基因正义表达载体的构建4
1.3.6 AaDFR转化矮牵牛5
1.3.7 转基因植株的鉴定5
2 结果与分析5
2.1 AaDFR基因ORF扩增结果6
2.2 中间载体酶切结果7
2.3 pC1302AaDFR重组质粒双酶切验证结果7
2.4 AaDFR对矮牵牛的遗传转化7
3 讨论 7
3.1植物表达载体的构建7
3.2 AaDFR基因的矮牵牛转化8
致谢8
参考文献8
花烛AaDFR基因对矮牵牛的遗传转化研究
引言
矮牵牛(Petunia hybrida)又名碧冬茄，是茄科碧冬茄属多年生草本植物。1803年Jusseau确定了矮牵牛属，目前已知约有40种植物 [1]。因矮牵牛花朵较大，色彩丰富，花型多样，花期长，逐渐成为重要的花坛和盆栽用花，市场对其需求也越来越大[2]。我国在20世纪80年代末从荷兰、美国、日本等国家引进栽培后，便在全国开始广泛的使用[3]。
花色是植物重要的观赏性状之一，也是花卉改良的重点。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
由于矮牵牛植株再生容易，遗传背景清楚，且花器官较大，使它成为了进行遗传转化研究植物花色变化的模式植物。培良出符合大众审美需求的花色性状，是扩大矮牵牛产业规模的必经之路。传统的杂交育种、辐射育种等育种方法，会受到育种周期长、变异频率低和缺乏新型花色资源等原因的限制，已经非常难以满足矮牵牛遗传育种的需要。通过基因工程的手段，改变矮牵牛的遗传特性，从而促使花色发生改变，具有周期短、目的性强的优点，成为矮牵牛遗传育种的技术手段中发展潜力最大的一种[2]。
花色素苷是花、叶、种子和果实的主要色素，同时也在植物生长方面承担着多种不同的功能。例如，一些特异的类黄酮化合物可以通过吸收紫外线减少其对植物的伤害，还可以吸引昆虫授粉、同时抑制病虫害，也能够参与调节植物对生长素的反应。花色素应用前景广泛，不但可以作为安全的食用色素，还有重要的营养和药理价值[4] ，还有更广泛的应用前景有待发掘。20世纪80年代末至90年代初，植物花青素及类黄酮物质代谢途径已较为明确[5]，矮牵牛的花色素苷生物合成过程中，至少有12种酶参与，在花色素苷合成途径中二氢黄酮醇4还原酶(dihydroflavonol 4reductase,DFR)对花色素苷的最终形成起决定性作用[6]。 DFR为单基因编码，属于NADPH依赖性短链还原酶家族[7] 。DFR基因最初是由OReilly等于1985年采用转座子标签法从玉米( Zea mays )和金鱼草(Antirrhinum majus)中分离[8] ，是花青素生物合 成 途 径 的 关 键 酶 ，分 别 催 化 二 氢 山 萘 酚(dihydrokaempferol, DHK)、二 氢 栎 皮 黄 酮(dihydroquercetin, DHQ) 和 二 氢 杨 梅 黄 酮(dihydromyricetin, DHM) 生 成 无 色 花 葵 素(leucopelargonidin)、无色花青素(leucocyanidin)和无色翠雀素(leucodelphinidin)，然后这些无色花色素在花色素苷合成酶(anthcyanin synthase, ANS)和类黄酮3O糖基转移酶(flavonoid 3Oglucosyltransferase, FGT)的作用下合成各种花青素。由于DFR对底物的特异性和表达水平的不同，使植物呈现出各异的花色和果色[9]。
矮牵牛的 DFR 基因早在1989年被克隆出来，经后续研究发现，在矮牵牛的基因中，DFR 是一个多基因家族，共包含3个同源基因： DFRA，DFRB和DFRC，分别定位于Ⅳ、Ⅱ、Ⅵ染色体上，但只有DFRA基因在花组织中转录表达[10] 。DFRA由An6基因位点编码，其表达受到An1、An2、An4、An11等调节基因的调控[11]。矮牵牛DFR主要催化DHM生成无色花翠素，对DHQ也有催化作用，而对DHK则无作用，因此许多学者致力于导入外源 DFR来改变矮牵牛花色。1987年，Meyer等[12] 完成了世界上第一例通过基因工程技术改变花色的实例，他们成功将玉米 DFR 基因导入矮牵牛RL01突变体后，花色由白色变为淡砖红色。随后，月季、非洲菊、玉米等多种植物的DFR 都被尝试导入了矮牵牛，但未能获得预期的黄色矮牵牛。
在基因工程中，矮牵牛容易通过根癌农杆菌导入基因，1985年，Horsch等[13]就利用农杆菌介导技术第一次得到了矮牵牛转基因植株，这也为转基因方法的研究提供了十分有利的条件。因而农杆菌介导技术成为了矮牵牛的花色基因工程常用的操作。
为了分析在单子叶植物花烛中的DFR基因能否在双子叶植物矮牵牛中表达，并研究其对矮牵牛花色改变的影响，本文通过RTPCR技术在花烛品种‘Sonate’深绿突变体红色苞片中克隆AaDFR基因，并构建载体和转化矮牵牛株系，以获得转化植株，为深入研究花烛AaDFR基因的功能提供基础。
1 材料与方法
1．1 材料
花烛品种‘Sonate’红化型叶色突变体 (rubescent type)，由本实验室保存于大学自然光照温室，生长温度约为25°C /15°C (白天/夜间)。
1．2 主要试剂
总RNA分离试剂RNAiso Reageng，Taq酶、反转录酶Reverse Transcriptase MMLV, Oligo(dT)18 Primer, RNAase Inhibitor, dNTPs等均购自大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒Agarose Gel DNA Purification Kit 购自Biomiga公司；Taq Master Mix, pMD19T载体购自上海捷瑞生物工程公司；大肠杆菌菌株DH5α购自全式金公司；所有引物均由上海捷瑞生物工程公司合成。各限制性内切酶、T4连接酶等均购自Fermentas公司；质粒提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit及高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase均购自Takara公司；Kam、Rif 均购自生工生物工程（上海）有限公司；根癌农杆菌菌株EHA105由本实验室保存；植物载体pCAMBIA1302（以下简称pC1302）由本实验室保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.2 主要试剂 2
1.3 试验方法 3
1.3.1 总RNA提取与质量检测3
1.3.2 cDNA的合成3
1.3.3 AaDFR基因ORF扩增3
1.3.4 提取质粒4
1.3.5 AaDFR基因正义表达载体的构建4
1.3.6 AaDFR转化矮牵牛5
1.3.7 转基因植株的鉴定5
2 结果与分析5
2.1 AaDFR基因ORF扩增结果6
2.2 中间载体酶切结果7
2.3 pC1302AaDFR重组质粒双酶切验证结果7
2.4 AaDFR对矮牵牛的遗传转化7
3 讨论 7
3.1植物表达载体的构建7
3.2 AaDFR基因的矮牵牛转化8
致谢8
参考文献8
花烛AaDFR基因对矮牵牛的遗传转化研究
引言
矮牵牛(Petunia hybrida)又名碧冬茄，是茄科碧冬茄属多年生草本植物。1803年Jusseau确定了矮牵牛属，目前已知约有40种植物 [1]。因矮牵牛花朵较大，色彩丰富，花型多样，花期长，逐渐成为重要的花坛和盆栽用花，市场对其需求也越来越大[2]。我国在20世纪80年代末从荷兰、美国、日本等国家引进栽培后，便在全国开始广泛的使用[3]。
花色是植物重要的观赏性状之一，也是花卉改良的重点。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
由于矮牵牛植株再生容易，遗传背景清楚，且花器官较大，使它成为了进行遗传转化研究植物花色变化的模式植物。培良出符合大众审美需求的花色性状，是扩大矮牵牛产业规模的必经之路。传统的杂交育种、辐射育种等育种方法，会受到育种周期长、变异频率低和缺乏新型花色资源等原因的限制，已经非常难以满足矮牵牛遗传育种的需要。通过基因工程的手段，改变矮牵牛的遗传特性，从而促使花色发生改变，具有周期短、目的性强的优点，成为矮牵牛遗传育种的技术手段中发展潜力最大的一种[2]。
花色素苷是花、叶、种子和果实的主要色素，同时也在植物生长方面承担着多种不同的功能。例如，一些特异的类黄酮化合物可以通过吸收紫外线减少其对植物的伤害，还可以吸引昆虫授粉、同时抑制病虫害，也能够参与调节植物对生长素的反应。花色素应用前景广泛，不但可以作为安全的食用色素，还有重要的营养和药理价值[4] ，还有更广泛的应用前景有待发掘。20世纪80年代末至90年代初，植物花青素及类黄酮物质代谢途径已较为明确[5]，矮牵牛的花色素苷生物合成过程中，至少有12种酶参与，在花色素苷合成途径中二氢黄酮醇4还原酶(dihydroflavonol 4reductase,DFR)对花色素苷的最终形成起决定性作用[6]。 DFR为单基因编码，属于NADPH依赖性短链还原酶家族[7] 。DFR基因最初是由OReilly等于1985年采用转座子标签法从玉米( Zea mays )和金鱼草(Antirrhinum majus)中分离[8] ，是花青素生物合 成 途 径 的 关 键 酶 ，分 别 催 化 二 氢 山 萘 酚(dihydrokaempferol, DHK)、二 氢 栎 皮 黄 酮(dihydroquercetin, DHQ) 和 二 氢 杨 梅 黄 酮(dihydromyricetin, DHM) 生 成 无 色 花 葵 素(leucopelargonidin)、无色花青素(leucocyanidin)和无色翠雀素(leucodelphinidin)，然后这些无色花色素在花色素苷合成酶(anthcyanin synthase, ANS)和类黄酮3O糖基转移酶(flavonoid 3Oglucosyltransferase, FGT)的作用下合成各种花青素。由于DFR对底物的特异性和表达水平的不同，使植物呈现出各异的花色和果色[9]。
矮牵牛的 DFR 基因早在1989年被克隆出来，经后续研究发现，在矮牵牛的基因中，DFR 是一个多基因家族，共包含3个同源基因： DFRA，DFRB和DFRC，分别定位于Ⅳ、Ⅱ、Ⅵ染色体上，但只有DFRA基因在花组织中转录表达[10] 。DFRA由An6基因位点编码，其表达受到An1、An2、An4、An11等调节基因的调控[11]。矮牵牛DFR主要催化DHM生成无色花翠素，对DHQ也有催化作用，而对DHK则无作用，因此许多学者致力于导入外源 DFR来改变矮牵牛花色。1987年，Meyer等[12] 完成了世界上第一例通过基因工程技术改变花色的实例，他们成功将玉米 DFR 基因导入矮牵牛RL01突变体后，花色由白色变为淡砖红色。随后，月季、非洲菊、玉米等多种植物的DFR 都被尝试导入了矮牵牛，但未能获得预期的黄色矮牵牛。
在基因工程中，矮牵牛容易通过根癌农杆菌导入基因，1985年，Horsch等[13]就利用农杆菌介导技术第一次得到了矮牵牛转基因植株，这也为转基因方法的研究提供了十分有利的条件。因而农杆菌介导技术成为了矮牵牛的花色基因工程常用的操作。
为了分析在单子叶植物花烛中的DFR基因能否在双子叶植物矮牵牛中表达，并研究其对矮牵牛花色改变的影响，本文通过RTPCR技术在花烛品种‘Sonate’深绿突变体红色苞片中克隆AaDFR基因，并构建载体和转化矮牵牛株系，以获得转化植株，为深入研究花烛AaDFR基因的功能提供基础。
1 材料与方法
1．1 材料
花烛品种‘Sonate’红化型叶色突变体 (rubescent type)，由本实验室保存于大学自然光照温室，生长温度约为25°C /15°C (白天/夜间)。
1．2 主要试剂
总RNA分离试剂RNAiso Reageng，Taq酶、反转录酶Reverse Transcriptase MMLV, Oligo(dT)18 Primer, RNAase Inhibitor, dNTPs等均购自大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒Agarose Gel DNA Purification Kit 购自Biomiga公司；Taq Master Mix, pMD19T载体购自上海捷瑞生物工程公司；大肠杆菌菌株DH5α购自全式金公司；所有引物均由上海捷瑞生物工程公司合成。各限制性内切酶、T4连接酶等均购自Fermentas公司；质粒提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit及高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase均购自Takara公司；Kam、Rif 均购自生工生物工程（上海）有限公司；根癌农杆菌菌株EHA105由本实验室保存；植物载体pCAMBIA1302（以下简称pC1302）由本实验室保存。
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