gateway技术构建不结球白菜erf070过量表达载体
摘要：表达载体的构建在植物基因工程中占据非常重要的地位，直接关系到目的基因的表达效果。而Gateway技术是一项快速高效地构建植物表达载体的新技术。本实验主要研究拟南芥在ERF070基因的调控下，Vc含量的变化。利用Gateway技术，将ERF070基因连接到过表达载体pEarlyGate103上，构建ERF070过表达体系。初步研究不同胁迫下，不结球白菜ERF70基因的表达与抗坏血酸（AsA）含量变化的关系。实验结果表明，在盐胁迫下，过量表达ERF070基因使ASA含量降低，从而使植株对盐更敏感；而在茉莉酸甲酯MeJA的处理下，随着ERF070表达量的上升，ASA含量也上升。
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1材料与方法 5
1.1材料5
1. 1. 1 植物材料与菌株 5
1. 1. 2 试剂5
1.2方法 5
1. 2. 1 ERF70基因与pDONR221载体连接5
1. 2. 2 ERF070过表达载体的构建5
1. 2. 3重组质粒侵染农杆菌及拟南芥的遗传转化 5
1. 2. 4 Vc含量的测定5
2结论5
2. 1 植物表达载体的构建5
2. 1. 1 ERF070过量表达载体的构建5
2. 2 不同胁迫下，ASA含量的测定 6
2. 2. 1 Nacl处理下，ERF070的表达量与ASA的含量变化6
2. 2. 2 MeJA处理下，ERF070的表达量与ASA的含量变化6
讨论7 致谢8
参考文献9
图1 ERF070的PCR扩增结果6
图2 100μM Nacl处理下，ERF070表达量6
图3 100μM Nacl处理下，ASA含量6
图4 100μM MeJA处理下，ERF070表达量7
图5 100μM MeJA处理下，ASA含量7
基于Gateway技术构建不结球白菜ERF070过量表达
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载体
园艺院园艺112班 张玥
引言
不结球白菜 (Brassica campestris ssp . chinensis Makino) 俗称青菜、小白菜，原产中国 (侯喜林等 2005)，是十字花科芸薹属植物,在我国南北各地均有分布，栽培十分广泛。近年来，东南亚、日、美及欧洲一些国家也广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜 (侯喜林 2003)。 目前，大白菜测序已经完成，而耿建峰等 (2007) 利用不结球白菜品种暑绿已得到第一张不结球白菜遗传连锁图谱，并且本实验室也已经基本完成不结球白菜全基因的测序工作，这将为不结球白菜的植物表达载体的构建奠定基础。
在植物基因工程研究中,载体是携带目的DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达的媒介。没有载体,目的基因无法进入受体,即使进入受体细胞也无法表达。细菌质粒载体或噬菌体载体连接启动基因及多聚核糖体的基因序列就组成了表达载体。表达载体的构建工作很重要但又比较繁琐。因此,研究表达载体的构建方法具有非常重要的现实意义。
Gateway技术是Invitrogen公司开发的一项构建植物表达载体的新技术。它是以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础。需要BP和LR两个反应完成载体的构建。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体(Donor vector)之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。Gateway技术不再需要使用限制性内切酶和连接酶，一旦拥有一个入门载体，就可以利用它将目的基因多次转移到各种不同的表达载体上(林春晶等，2008)。因此，利用Gateway技术可以快速、高效地将目的基因同时构建到多种与Gateway技术兼容的载体系统中，用于基因的表达及功能分析。目前，Gateway技术在植物基因工程中的研究已广泛使用，例如：郭姗姗等（2011）的基于Gateway技术改造的载体，在植物中进行高通量功能筛选的研究；Busso等（2005）的基Gateway技术的目标载体，以在大肠杆菌中用作高通量克隆和表达筛选的研究；李晨等（2010）的以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库的研究；徐品三等（2011）的利用Gateway 技术，将 LSVLMoV 融合基因克隆到双元载体 pH7GWIWG2(Ⅱ)，成功构建了含2种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)LSVLMoV 的研究。因此，根据前人的研究，在本实验中，需要构建植物表达载体，研究不结球白菜中ERF070基因引起的ASA含量变化。
抗坏血酸（LAscorbic acid, AsA），又叫维生素C（维他命C，VC），是普遍存在于动植物体中的高丰度的水溶性的己糖内酯化合物。AsA是维持人类及动物生命活动并保证其健康所必需的营养物质，它可以预防人类心血管病的发生和提高人体机体免疫能力(Carr和Frei 1999; Barth等2010; Mukherjee等2010)。在植物中，AsA可以直接或者间接的清理植物体产生的过剩的活性氧（ROS）；同时它在光合作用、细胞分裂、植株生长、诱导开花、延缓衰老、激素合成以及植物抗逆性反应中起着至关重要的作用。因此， AsA含量是一个衡量水果、蔬菜等农产品品质的重要指标。Sairam和Srivastava（2002）中发现盐胁迫下小麦植株AsA含量明显降低，且耐盐品种的降低幅度小于盐敏感品种。Chen和Gallie（2004，2005）中发现过量表达烟草中的DHAR，保卫细胞对臭氧的敏感性减弱，使得更多的臭氧进入叶片中。但是过量表达DHAR后，AsA的再生力增强，进而可以更好消除臭氧产生的氧胁迫，使得叶片处于较低的氧化胁迫下，进而提高光合作用，增强抗臭氧能力。相反的，当抑制DHAR的表达后，保卫细胞对臭氧敏感，使得相对较少的臭氧进入叶片，但是同时减少了AsA的再生速度，进而使的光合作用减少，耐胁迫力减弱，植株收到更严重的损伤。Eltayeb等（2006）中发现臭氧诱导DHAR的表达，拟南芥中的胞质DHAR转入烟草后，AsA含量增加了2倍，同时对臭氧、干旱等的耐受力。
ERFs（Ethyleneresponsive element binding factors）转录因子，属于植物特有的AP2/EREBP转录因子超基因家族中的一个亚家族，它们能够通过进化上保守的DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD）特异性地结合靶基因5上游调控区的顺式作用元件，参与植物多种生理功能以及逆境应答相关基因的调节。ERF70是一种主要与抗逆境和Vc含量相关的因子。一些前人的相关研究，如下：Zhang 等的研究表明转基因烟草中过量表达GmERF3 可以提高植物对高盐和干旱的抗性, 在干旱条件下, 转基因植株中游离脯氨酸和可溶性碳水化合物的含量显著高于非转基因株系。Abogadallah 等的研究中将拟南芥HARDY 基因转入埃及车轴草(Trifolium alexandrinum Linn.), 干旱胁迫条件下, 转基因植物重增加42%和55%, 在盐害胁迫条件下, 转基因植物鲜重增加38%和95%。在干旱条件下, 转基因植物通过减少蒸腾来增加水的利用率。在盐害条件下, 通过增加光合、减少叶片中Na离子的量、减少蒸腾来提高水的有效利用率。转拟南芥HARDY 基因埃及车轴草通过减少蒸腾和钠吸收来提高植物对盐和干旱的抗性。目前研究表明只有ERF98转录因子可以促进ASA合成相关基因的表达，从而提高ASA的含量，增强植株对盐胁迫的忍受能力（Zhijin Zhang等）。
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1材料与方法 5
1.1材料5
1. 1. 1 植物材料与菌株 5
1. 1. 2 试剂5
1.2方法 5
1. 2. 1 ERF70基因与pDONR221载体连接5
1. 2. 2 ERF070过表达载体的构建5
1. 2. 3重组质粒侵染农杆菌及拟南芥的遗传转化 5
1. 2. 4 Vc含量的测定5
2结论5
2. 1 植物表达载体的构建5
2. 1. 1 ERF070过量表达载体的构建5
2. 2 不同胁迫下，ASA含量的测定 6
2. 2. 1 Nacl处理下，ERF070的表达量与ASA的含量变化6
2. 2. 2 MeJA处理下，ERF070的表达量与ASA的含量变化6
讨论7 致谢8
参考文献9
图1 ERF070的PCR扩增结果6
图2 100μM Nacl处理下，ERF070表达量6
图3 100μM Nacl处理下，ASA含量6
图4 100μM MeJA处理下，ERF070表达量7
图5 100μM MeJA处理下，ASA含量7
基于Gateway技术构建不结球白菜ERF070过量表达
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载体
园艺院园艺112班 张玥
引言
不结球白菜 (Brassica campestris ssp . chinensis Makino) 俗称青菜、小白菜，原产中国 (侯喜林等 2005)，是十字花科芸薹属植物,在我国南北各地均有分布，栽培十分广泛。近年来，东南亚、日、美及欧洲一些国家也广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜 (侯喜林 2003)。 目前，大白菜测序已经完成，而耿建峰等 (2007) 利用不结球白菜品种暑绿已得到第一张不结球白菜遗传连锁图谱，并且本实验室也已经基本完成不结球白菜全基因的测序工作，这将为不结球白菜的植物表达载体的构建奠定基础。
在植物基因工程研究中,载体是携带目的DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达的媒介。没有载体,目的基因无法进入受体,即使进入受体细胞也无法表达。细菌质粒载体或噬菌体载体连接启动基因及多聚核糖体的基因序列就组成了表达载体。表达载体的构建工作很重要但又比较繁琐。因此,研究表达载体的构建方法具有非常重要的现实意义。
Gateway技术是Invitrogen公司开发的一项构建植物表达载体的新技术。它是以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础。需要BP和LR两个反应完成载体的构建。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体(Donor vector)之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。Gateway技术不再需要使用限制性内切酶和连接酶，一旦拥有一个入门载体，就可以利用它将目的基因多次转移到各种不同的表达载体上(林春晶等，2008)。因此，利用Gateway技术可以快速、高效地将目的基因同时构建到多种与Gateway技术兼容的载体系统中，用于基因的表达及功能分析。目前，Gateway技术在植物基因工程中的研究已广泛使用，例如：郭姗姗等（2011）的基于Gateway技术改造的载体，在植物中进行高通量功能筛选的研究；Busso等（2005）的基Gateway技术的目标载体，以在大肠杆菌中用作高通量克隆和表达筛选的研究；李晨等（2010）的以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库的研究；徐品三等（2011）的利用Gateway 技术，将 LSVLMoV 融合基因克隆到双元载体 pH7GWIWG2(Ⅱ)，成功构建了含2种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)LSVLMoV 的研究。因此，根据前人的研究，在本实验中，需要构建植物表达载体，研究不结球白菜中ERF070基因引起的ASA含量变化。
抗坏血酸（LAscorbic acid, AsA），又叫维生素C（维他命C，VC），是普遍存在于动植物体中的高丰度的水溶性的己糖内酯化合物。AsA是维持人类及动物生命活动并保证其健康所必需的营养物质，它可以预防人类心血管病的发生和提高人体机体免疫能力(Carr和Frei 1999; Barth等2010; Mukherjee等2010)。在植物中，AsA可以直接或者间接的清理植物体产生的过剩的活性氧（ROS）；同时它在光合作用、细胞分裂、植株生长、诱导开花、延缓衰老、激素合成以及植物抗逆性反应中起着至关重要的作用。因此， AsA含量是一个衡量水果、蔬菜等农产品品质的重要指标。Sairam和Srivastava（2002）中发现盐胁迫下小麦植株AsA含量明显降低，且耐盐品种的降低幅度小于盐敏感品种。Chen和Gallie（2004，2005）中发现过量表达烟草中的DHAR，保卫细胞对臭氧的敏感性减弱，使得更多的臭氧进入叶片中。但是过量表达DHAR后，AsA的再生力增强，进而可以更好消除臭氧产生的氧胁迫，使得叶片处于较低的氧化胁迫下，进而提高光合作用，增强抗臭氧能力。相反的，当抑制DHAR的表达后，保卫细胞对臭氧敏感，使得相对较少的臭氧进入叶片，但是同时减少了AsA的再生速度，进而使的光合作用减少，耐胁迫力减弱，植株收到更严重的损伤。Eltayeb等（2006）中发现臭氧诱导DHAR的表达，拟南芥中的胞质DHAR转入烟草后，AsA含量增加了2倍，同时对臭氧、干旱等的耐受力。
ERFs（Ethyleneresponsive element binding factors）转录因子，属于植物特有的AP2/EREBP转录因子超基因家族中的一个亚家族，它们能够通过进化上保守的DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD）特异性地结合靶基因5上游调控区的顺式作用元件，参与植物多种生理功能以及逆境应答相关基因的调节。ERF70是一种主要与抗逆境和Vc含量相关的因子。一些前人的相关研究，如下：Zhang 等的研究表明转基因烟草中过量表达GmERF3 可以提高植物对高盐和干旱的抗性, 在干旱条件下, 转基因植株中游离脯氨酸和可溶性碳水化合物的含量显著高于非转基因株系。Abogadallah 等的研究中将拟南芥HARDY 基因转入埃及车轴草(Trifolium alexandrinum Linn.), 干旱胁迫条件下, 转基因植物重增加42%和55%, 在盐害胁迫条件下, 转基因植物鲜重增加38%和95%。在干旱条件下, 转基因植物通过减少蒸腾来增加水的利用率。在盐害条件下, 通过增加光合、减少叶片中Na离子的量、减少蒸腾来提高水的有效利用率。转拟南芥HARDY 基因埃及车轴草通过减少蒸腾和钠吸收来提高植物对盐和干旱的抗性。目前研究表明只有ERF98转录因子可以促进ASA合成相关基因的表达，从而提高ASA的含量，增强植株对盐胁迫的忍受能力（Zhijin Zhang等）。
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