异三聚体gprotein的克隆及其对氮素吸收调节的功能性分析
摘要：【目的】以一种梨资源品种为研究对象，通过研究其异三聚体G蛋白的调控基因，分析异三聚体G蛋白对梨吸收氮素的调控作用，从而通过调节异三聚体G蛋白的活性来控制梨对氮素的吸收利用率。【方法】用不同的氮素浓度处理同一梨资源品种，观察其表型差异；用半定量分析的方法测定其基因表达量；并用分子生物学的方法克隆G蛋白相关基因，通过亚细胞定位分析验证其功能。【结果】通过对基因进行半定量检测，发现用不同浓度氮素处理梨苗，其不同浓度下下梨苗中异三聚体G蛋白的表达量表现出了明显的不同。当缺氮条件下，梨苗根和叶中的异三体G蛋白在转录水平被高效诱导表达，说明异三聚体G蛋白有可能参与氮素的吸收及转运过程。通过对异三聚体G蛋白的各个亚基进行亚细胞定位及蛋白互作表明， 异三聚体G蛋白对梨树根系吸收氮素的调控具有重要的作用.【结论】异三聚体G蛋白与梨树对氮素的吸收与转运有关。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 试验材料及其培养 2
1．2 方法 2
1. 2. 1 异三聚体G蛋白基因克隆及鉴定 2
1. 2. 2 构建中间表达载体 4
1. 2. 3 中间表达载体质粒检测 4
1. 2. 4 构建最终表达载体 5
1. 2. 5 最终表达载体质粒检测 5
1. 2. 6 提取最终表达载体的质粒 5
2 结果与分析 6
2．1 异三聚体G蛋白与梨氮素吸收的相关性分析 6
2．2 梨苗缺氮高效表达的异三聚体G蛋白基因的克隆 6
2. 2. 1梨苗根和叶总RNA的提取 6
2. 2. 2 异三聚体基因的克隆 6
2．3 异三聚体Ｇ蛋白基因与中间载体的连接与鉴定 6
2．4 目的基因与最终载体的连接与鉴定 8
2．5 最终表达载体质粒的提取 8
3 讨论 8
3．1异三聚体G蛋白与植物氮素吸收的联系 8
致谢 9
参考文献 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
异三聚体Gprotein的克隆及其对氮素吸收调节的功能性分析
引言
引言
【研究意义】氮是促进植物生长和发育所必需的大量营养元素之一，是氨基酸、蛋白质、核酸、叶绿素、激素等的组成成分。生产上一般通过施用大量氮肥来提高作物产量，但是大量施用氮肥会造成严重的资源浪费和环境问题。异三聚体G蛋白是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质，因其生理调节功能有赖于三磷酸鸟苷(GTP)的结合与水解，故而得名，它包括α、β、γ三个亚基。通过研究异三聚体G蛋白对梨吸收和转运过程中的影响，从而达到利用G蛋白的活性调节梨树对氮素的利用率，是一个可持续的发展策略。【前人研究进展】一、氮素的生理功能 a、氮素影响植物的光合作用。有研究结果显示，在一定范围内，植物的光合速率随植物体内氮素营养水平的提高而提高，但植物体内氮含量过高时，植物的光合作用反而会受到抑制。这是因为碳同化和氮同化是植物体内两个既相互制约又相互促进的生理过程，氮同化通过影响碳同化过程中关键酶活性而影响植物碳同化的速率，从而影响光合速率[1]。 b、氮素影响植物体内的抗氧化系统。植物体内的氮素营养水平对抗氧化保护酶的活性有显著的影响。通过对小麦等植物的研究发现，随着植物体内氮素营养水平的提高，其体内SOD、POD、CAT 等酶的活性明显增强，而体内MDA的含量则明显下降，从而延缓植物叶片衰老[2]。c、氮素影响植物水分吸收利用。研究表明：氮素在植物体内与水分有正向交互作用，氮素营养水平可以通过影响植物体内的水分生理影响植物的生长发育[3]。d、氮素影响植物内源激素水平。氮素也参与了植物气孔的调节，ABA在植物体内的含量随着氮素含量的增加而增加，适宜的氮素营养条件可以降低植物叶片中的ABA的水平，维持植物的气孔开度，提高植物的光合速率[45]。二、异三聚体G蛋白与阴离子通道 拟南芥保卫细胞阴离子通道能被ABA和S1P激活。Gα突变体gpal消除了S1P激活激活的阴离子通道，说明了G蛋白有可能在该途径中必不可少[6]。在拟南芥中三种离子(K+、Ca2+、阴离子)通道都被证实有G蛋白的参与(Pandeyetal.，2007;Nilson and Assmann， 2010)。ABA通过参与离子通道的调节，抑制气孔开放，促进气孔关闭(Schroederetal.，1989， 2001 )。对的研究实验证明GPA1在ABA抑制气孔开放的三种离子通道信号中都起到了正调节作用(Wangetal.，2001; Zhang etal.， 2011)。目前，通过对水稻的DEP1蛋白进行酵母双杂交实验和荧光双分子分析显示，DEP1的GGL (Gprotein γlike)区域与水稻中的β亚基（RGB1）相互作用，影响了水稻对氮素的吸收。这些结果表明提高RGB1的活性或者增加DEP1 和 RGB1之间的反应强度能够抑制其对氮响应。发现氮素与异三聚体G蛋白的信号关系能够理解氮素调控植株生长和发育的过程[7]。【本研究切入点】本课题以‘鸭梨’为研究对象，观察其在不同氮素浓度下的表型差异，对控制梨异三聚体G蛋白的基因进行研究，通过亚细胞定位，分析异三聚体G蛋白对梨吸收氮素的影响机制，从而达到通过控制G蛋白活性来调节梨的氮素利用率的目的。【拟解决的关键问题】(1)从不同氮素浓度下生长的梨苗的根和叶中提取纯净的RNA。(2)半定量分析异三聚体G蛋白与氮素吸收之间的联系。（3）获取正确的目的基因片段，并成功的导入载体中。(4)提取纯净的最终连接产物质粒，转入拟南芥原生质体。(5)亚细胞定位。
1 材料与方法
1．1 试验材料及其培养
本研究于2014年9月开始在大学梨中心实验室进行，所用材料均来自于大学梨中心实验室的梨资源品种，本实验以梨品种‘鸭梨’（Pyrus bretschneideri Rehd.cv.’Yali’）为研究对象。植物材料的培养采用水培的方式，分别用0 ml/L、4 ml/L、16 ml/L、32 ml/L氮素浓度的营养液培养梨苗，其他条件一致，培养4周，观察不同氮素浓度下梨苗叶片和根系表型特征。通过观察，我们发现不同氮素浓度梯度下，同一品种梨苗表型有差异。
1．2 方法
1. 2. 1 异三聚体G蛋白基因克隆及鉴定
提取总的RNA。选取健康无病毒的梨树苗的根和叶，提取总RNA。采用快速提
取RNA的方法提取RNA，具体步骤如下：
取梨苗材料，将其根与叶分离，并分别用干冰研磨；
往研磨的样品中加入RNA提取液1 ml，β巯基乙醇50 μL；
65℃水浴锅中水浴5 min，摇匀；
4℃，12000 rpm离心15 min，吸上清液于2 ml离心管中；
加1 ml 24：1（氯仿：异戊醇）于上清液中，剧烈震荡5 min；
4℃，12000 rpm离心10 min，转移上清液于2 ml离心管中；
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 试验材料及其培养 2
1．2 方法 2
1. 2. 1 异三聚体G蛋白基因克隆及鉴定 2
1. 2. 2 构建中间表达载体 4
1. 2. 3 中间表达载体质粒检测 4
1. 2. 4 构建最终表达载体 5
1. 2. 5 最终表达载体质粒检测 5
1. 2. 6 提取最终表达载体的质粒 5
2 结果与分析 6
2．1 异三聚体G蛋白与梨氮素吸收的相关性分析 6
2．2 梨苗缺氮高效表达的异三聚体G蛋白基因的克隆 6
2. 2. 1梨苗根和叶总RNA的提取 6
2. 2. 2 异三聚体基因的克隆 6
2．3 异三聚体Ｇ蛋白基因与中间载体的连接与鉴定 6
2．4 目的基因与最终载体的连接与鉴定 8
2．5 最终表达载体质粒的提取 8
3 讨论 8
3．1异三聚体G蛋白与植物氮素吸收的联系 8
致谢 9
参考文献 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
异三聚体Gprotein的克隆及其对氮素吸收调节的功能性分析
引言
引言
【研究意义】氮是促进植物生长和发育所必需的大量营养元素之一，是氨基酸、蛋白质、核酸、叶绿素、激素等的组成成分。生产上一般通过施用大量氮肥来提高作物产量，但是大量施用氮肥会造成严重的资源浪费和环境问题。异三聚体G蛋白是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质，因其生理调节功能有赖于三磷酸鸟苷(GTP)的结合与水解，故而得名，它包括α、β、γ三个亚基。通过研究异三聚体G蛋白对梨吸收和转运过程中的影响，从而达到利用G蛋白的活性调节梨树对氮素的利用率，是一个可持续的发展策略。【前人研究进展】一、氮素的生理功能 a、氮素影响植物的光合作用。有研究结果显示，在一定范围内，植物的光合速率随植物体内氮素营养水平的提高而提高，但植物体内氮含量过高时，植物的光合作用反而会受到抑制。这是因为碳同化和氮同化是植物体内两个既相互制约又相互促进的生理过程，氮同化通过影响碳同化过程中关键酶活性而影响植物碳同化的速率，从而影响光合速率[1]。 b、氮素影响植物体内的抗氧化系统。植物体内的氮素营养水平对抗氧化保护酶的活性有显著的影响。通过对小麦等植物的研究发现，随着植物体内氮素营养水平的提高，其体内SOD、POD、CAT 等酶的活性明显增强，而体内MDA的含量则明显下降，从而延缓植物叶片衰老[2]。c、氮素影响植物水分吸收利用。研究表明：氮素在植物体内与水分有正向交互作用，氮素营养水平可以通过影响植物体内的水分生理影响植物的生长发育[3]。d、氮素影响植物内源激素水平。氮素也参与了植物气孔的调节，ABA在植物体内的含量随着氮素含量的增加而增加，适宜的氮素营养条件可以降低植物叶片中的ABA的水平，维持植物的气孔开度，提高植物的光合速率[45]。二、异三聚体G蛋白与阴离子通道 拟南芥保卫细胞阴离子通道能被ABA和S1P激活。Gα突变体gpal消除了S1P激活激活的阴离子通道，说明了G蛋白有可能在该途径中必不可少[6]。在拟南芥中三种离子(K+、Ca2+、阴离子)通道都被证实有G蛋白的参与(Pandeyetal.，2007;Nilson and Assmann， 2010)。ABA通过参与离子通道的调节，抑制气孔开放，促进气孔关闭(Schroederetal.，1989， 2001 )。对的研究实验证明GPA1在ABA抑制气孔开放的三种离子通道信号中都起到了正调节作用(Wangetal.，2001; Zhang etal.， 2011)。目前，通过对水稻的DEP1蛋白进行酵母双杂交实验和荧光双分子分析显示，DEP1的GGL (Gprotein γlike)区域与水稻中的β亚基（RGB1）相互作用，影响了水稻对氮素的吸收。这些结果表明提高RGB1的活性或者增加DEP1 和 RGB1之间的反应强度能够抑制其对氮响应。发现氮素与异三聚体G蛋白的信号关系能够理解氮素调控植株生长和发育的过程[7]。【本研究切入点】本课题以‘鸭梨’为研究对象，观察其在不同氮素浓度下的表型差异，对控制梨异三聚体G蛋白的基因进行研究，通过亚细胞定位，分析异三聚体G蛋白对梨吸收氮素的影响机制，从而达到通过控制G蛋白活性来调节梨的氮素利用率的目的。【拟解决的关键问题】(1)从不同氮素浓度下生长的梨苗的根和叶中提取纯净的RNA。(2)半定量分析异三聚体G蛋白与氮素吸收之间的联系。（3）获取正确的目的基因片段，并成功的导入载体中。(4)提取纯净的最终连接产物质粒，转入拟南芥原生质体。(5)亚细胞定位。
1 材料与方法
1．1 试验材料及其培养
本研究于2014年9月开始在大学梨中心实验室进行，所用材料均来自于大学梨中心实验室的梨资源品种，本实验以梨品种‘鸭梨’（Pyrus bretschneideri Rehd.cv.’Yali’）为研究对象。植物材料的培养采用水培的方式，分别用0 ml/L、4 ml/L、16 ml/L、32 ml/L氮素浓度的营养液培养梨苗，其他条件一致，培养4周，观察不同氮素浓度下梨苗叶片和根系表型特征。通过观察，我们发现不同氮素浓度梯度下，同一品种梨苗表型有差异。
1．2 方法
1. 2. 1 异三聚体G蛋白基因克隆及鉴定
提取总的RNA。选取健康无病毒的梨树苗的根和叶，提取总RNA。采用快速提
取RNA的方法提取RNA，具体步骤如下：
取梨苗材料，将其根与叶分离，并分别用干冰研磨；
往研磨的样品中加入RNA提取液1 ml，β巯基乙醇50 μL；
65℃水浴锅中水浴5 min，摇匀；
4℃，12000 rpm离心15 min，吸上清液于2 ml离心管中；
加1 ml 24：1（氯仿：异戊醇）于上清液中，剧烈震荡5 min；
4℃，12000 rpm离心10 min，转移上清液于2 ml离心管中；
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/yy/675.html
