辣椒青枯病拮抗菌的筛选
目录
1引言 1
2 材料与方法 2
2.1 实验材料 2
2.2 试验方法 2
3 结果与分析 5
3.1 病菌的分离和纯化 5
3.2 拮抗菌对辣椒青枯病病原菌的抑制作用 6
3.3 辣椒青枯病拮抗菌的鉴定 6
3.3拮抗菌抗病盆栽实验 6
4 讨论 7
结 论 8
致 谢 9
参 考 文 献 10
1 引言
辣椒(Capsicum annuum L.)，茄科、辣椒属。为一年或有限多年生草本 植物 。俗称辣子、香椒、辣茄、番椒、海椒、椒角、大椒等，属茄科辣椒属，一年生草木，热带为多年生灌木。浆果、幼果绿色，熟果红或橙黄色[1]。近年来，辣椒成为“誉满全球”的嗜好性食物，深受人们喜爱，有“一餐无辣饭不饱”和“不怕辣”、“辣不怕”之说。这与辣椒所具有的营养和医疗保健功能密切相关。辣椒是人们生活中必不可少的一种重要蔬菜，且辣椒的栽培量和消费量在国内各类蔬菜中居于首要地位。但是，在辣椒的种植和收获过程中，往往会出现各种病害，使辣椒产量和品质大幅度下降，成为辣椒高产优产的限制因素[2]。
辣椒青枯病是茄科蔬菜的主要病害，除为害辣椒外，还为害番茄、马铃薯、茄子、芝麻、花生、大豆、萝卜等茄科蔬菜以及烟草、桑 、香蕉等经济作物受害较重。随着研究的发展，新寄主的发现，以及近年来气温转暖等因素，青枯病发生越来越普遍，并日趋严重。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
辣椒青枯病是茄科蔬菜的主要病害，除为害辣椒外，还为害番茄、马铃薯、茄子、芝麻、花生、大豆、萝卜等茄科蔬菜以及烟草、桑 、香蕉等经济作物受害较重。病原菌为茄科劳尔氏菌（ Ralstonia solanacearum ）细菌，劳尔氏菌属[3]。 菌体短杆状，两端钝圆，极生鞭毛。不产生荚膜，无芽孢，好气性，革兰氏染色反应为阴性。在琼脂培养基上形成污白色、褐色乃至黑褐色的圆形或不整圆形菌落，平滑，有光泽。青枯病菌从辣椒根部侵染，植株的细根首先褐变，不久后开始腐烂并且消失。切开接近地面部位的病茎，可以发现维管束微有褐变，并从该部位分泌出白色浑浊污汁。主要症状是植株迅速萎蔫、枯死，茎叶仍保持绿色。病茎的褐变部位用手挤压，有乳白色菌液排出。在高温高湿、重茬连作、地洼土黏、田间积水、土壤偏酸、偏施氮肥多种情况下，该病均容易发生。
辣椒青枯病病原为青枯假单胞杆菌，属细菌[4]。病菌以腐生或存于土壤、病株残体中越冬，由流水、雨水、昆虫和受污染的肥料、病苗及含菌的泥土传播。从寄主的根部或茎部的皮孔或伤口侵入。前期处于潜伏状态，5 月上、中旬初见病株，6 月上、中旬为发病高峰期。
青枯病菌能够随病株残体一同进入土壤。长期生存形成侵染源。青枯病菌在干燥的土壤中只能生活几天，而在湿度大的土壤中却可以生存几个月甚至几年。生存在土壤中的青枯菌主要是由于农田作业过程中造成的伤口或者是由于根瘤线虫、蓝光丽金龟幼虫类的根部害虫造成的伤口侵染植株，在茎的导管部位和根部发病[5]。
目前,对辣椒青枯病的防治还主要是以化学防治为主,但防治效果较低。生物防治制剂链霉素、单一生物防治菌剂防治效果较高，但防治效果不稳定，依赖环境性强[6]。 主要原因是生物防治菌株拮抗能力不稳定或定殖竞争能力弱等. 因此，筛选拮抗能力和竞争定殖力强的生物防治菌株，是辣椒青枯病的突破口，也是辣椒青枯病生物防治的基础。
2 材料与方法
2.1 实验材料
辣椒品种：日本朝天椒为主品种，8819线椒，韩育特大牛角椒；辣椒青枯病病原菌，由取自淮安市清浦区黄码乡三乐村红椒生产基地田间采样分离纯化后获得。
2.2 试验方法
试验分三个部分，前期准备试验阶段，包括青枯病病原菌的分离与纯化，继而是分别从辣椒病株和病株根部土壤中提取病原菌，而后为在温室及植物生长培养箱进行的室内盆栽防治观察试验。
2.2.1 病原菌的分离与纯化
2015年3月从淮安市清浦区黄码乡三乐村红椒生产基地采到患有青枯病的辣椒植株为来源试验材料，在实验室将带病植株茎基部消毒后实验室分离纯化病原菌，得到纯培养病原菌。
1 病原菌的分离培养 切下从田间取回的供试辣椒病株根部上方2cm的茎杆1 段，长5cm，在70%酒精中浸泡2秒后、移到酒精灯上，烧去附着在茎杆表面的酒精。将烧过的茎杆用灭菌水漂洗3次，放入另一灭菌培养皿，用灭菌手术刀切去两端少许，然后纵向剖开，以纵切面朝下将茎杆用无菌操作的方法放置在TTC培养基平板中央盖上皿盖，做好标记，放置在30℃培养箱内培养[7]。前两天主要观察是否被杂菌污染，3～4天后观察待分离菌生长结果。
2 病原菌的纯化 约5天后菌落长出，观察分离的病枝组织处细菌菌落的特征，然后在无菌操作台上进行纯化。用规格为6 mm打孔器选取菌落，转接于新的培养基上，在20℃左右的恒温箱内进行纯化培养，日后观察菌落生长情况[8]。
3 梯度稀释涂板法分离拮抗细菌
土壤悬浮液制备：
a 称取研细的土样1g，倒入试管中，加入无菌水定容至10ml，充分振荡10分钟，静置待土粒沉淀。
b 9ml灭菌水＋1ml土壤悬浮液，充分混匀，即1/100浓度。
c 依次配制，1/1000浓度。
d 同上，即1/10000浓度。
e 同上，即1/100000浓度。
在稀释时，可在盛有无菌水的试管中加入1滴100g/L的石炭酸溶液，用以抑制细菌生长。
接种方法：d或e土壤溶液，每皿加入20～30μl，用吸管吸0.1ml(2滴)，取用无菌三角玻璃棒涂抹接种。
培养：在28℃下培养3-5天并观察
4 病原菌的鉴定 将分离纯化的病原菌接种到健康的无病辣椒植株上，观察辣椒是否产生与原来青枯病相同的病害，如相同则可进行下一步实验，若不是则需要继续分离提纯。采用伤根淋灌菌液接种法进行接种[9]。
2.2.2 拮抗菌的筛选
1 拮抗菌的分离和初筛 将病原菌接种于液体TTC培养基，30℃、170 r m in- 1振荡培养36 h，离心收集菌体并用无菌水重悬，放置于70%酒精和10% 双氧水消毒的无菌喷瓶里，然后对准无菌TTC平板均匀地喷上病原菌菌悬液，制成含菌平板[10]。晾干后再倒上一层薄薄的NA 培养基，制成双层平板。将土样进行梯度稀释，取10- 4 ~ 10- 8浓度的稀释液涂布双层平板，30℃倒置培养，挑出有拮抗圈的菌落，并点接TTC 平板上，30℃倒置培养24h后，取喷瓶对准平板均匀地喷上病原菌菌悬液，继续30℃倒置培养，选择抑菌圈直径大的菌株。
参 考 文 献
1引言 1
2 材料与方法 2
2.1 实验材料 2
2.2 试验方法 2
3 结果与分析 5
3.1 病菌的分离和纯化 5
3.2 拮抗菌对辣椒青枯病病原菌的抑制作用 6
3.3 辣椒青枯病拮抗菌的鉴定 6
3.3拮抗菌抗病盆栽实验 6
4 讨论 7
结 论 8
致 谢 9
参 考 文 献 10
1 引言
辣椒(Capsicum annuum L.)，茄科、辣椒属。为一年
辣椒青枯病是茄科蔬菜的主要病害，除为害辣椒外，还为害番茄、马铃薯、茄子、芝麻、花生、大豆、萝卜等茄科蔬菜以及烟草、桑 、香蕉等经济作物受害较重。随着研究的发展，新寄主的发现，以及近年来气温转暖等因素，青枯病发生越来越普遍，并日趋严重。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
辣椒青枯病是茄科蔬菜的主要病害，除为害辣椒外，还为害番茄、马铃薯、茄子、芝麻、花生、大豆、萝卜等茄科蔬菜以及烟草、桑 、香蕉等经济作物受害较重。病原菌为茄科劳尔氏菌（ Ralstonia solanacearum ）细菌，劳尔氏菌属[3]。 菌体短杆状，两端钝圆，极生鞭毛。不产生荚膜，无芽孢，好气性，革兰氏染色反应为阴性。在琼脂培养基上形成污白色、褐色乃至黑褐色的圆形或不整圆形菌落，平滑，有光泽。青枯病菌从辣椒根部侵染，植株的细根首先褐变，不久后开始腐烂并且消失。切开接近地面部位的病茎，可以发现维管束微有褐变，并从该部位分泌出白色浑浊污汁。主要症状是植株迅速萎蔫、枯死，茎叶仍保持绿色。病茎的褐变部位用手挤压，有乳白色菌液排出。在高温高湿、重茬连作、地洼土黏、田间积水、土壤偏酸、偏施氮肥多种情况下，该病均容易发生。
辣椒青枯病病原为青枯假单胞杆菌，属细菌[4]。病菌以腐生或存于土壤、病株残体中越冬，由流水、雨水、昆虫和受污染的肥料、病苗及含菌的泥土传播。从寄主的根部或茎部的皮孔或伤口侵入。前期处于潜伏状态，5 月上、中旬初见病株，6 月上、中旬为发病高峰期。
青枯病菌能够随病株残体一同进入土壤。长期生存形成侵染源。青枯病菌在干燥的土壤中只能生活几天，而在湿度大的土壤中却可以生存几个月甚至几年。生存在土壤中的青枯菌主要是由于农田作业过程中造成的伤口或者是由于根瘤线虫、蓝光丽金龟幼虫类的根部害虫造成的伤口侵染植株，在茎的导管部位和根部发病[5]。
目前,对辣椒青枯病的防治还主要是以化学防治为主,但防治效果较低。生物防治制剂链霉素、单一生物防治菌剂防治效果较高，但防治效果不稳定，依赖环境性强[6]。 主要原因是生物防治菌株拮抗能力不稳定或定殖竞争能力弱等. 因此，筛选拮抗能力和竞争定殖力强的生物防治菌株，是辣椒青枯病的突破口，也是辣椒青枯病生物防治的基础。
2 材料与方法
2.1 实验材料
辣椒品种：日本朝天椒为主品种，8819线椒，韩育特大牛角椒；辣椒青枯病病原菌，由取自淮安市清浦区黄码乡三乐村红椒生产基地田间采样分离纯化后获得。
2.2 试验方法
试验分三个部分，前期准备试验阶段，包括青枯病病原菌的分离与纯化，继而是分别从辣椒病株和病株根部土壤中提取病原菌，而后为在温室及植物生长培养箱进行的室内盆栽防治观察试验。
2.2.1 病原菌的分离与纯化
2015年3月从淮安市清浦区黄码乡三乐村红椒生产基地采到患有青枯病的辣椒植株为来源试验材料，在实验室将带病植株茎基部消毒后实验室分离纯化病原菌，得到纯培养病原菌。
1 病原菌的分离培养 切下从田间取回的供试辣椒病株根部上方2cm的茎杆1 段，长5cm，在70%酒精中浸泡2秒后、移到酒精灯上，烧去附着在茎杆表面的酒精。将烧过的茎杆用灭菌水漂洗3次，放入另一灭菌培养皿，用灭菌手术刀切去两端少许，然后纵向剖开，以纵切面朝下将茎杆用无菌操作的方法放置在TTC培养基平板中央盖上皿盖，做好标记，放置在30℃培养箱内培养[7]。前两天主要观察是否被杂菌污染，3～4天后观察待分离菌生长结果。
2 病原菌的纯化 约5天后菌落长出，观察分离的病枝组织处细菌菌落的特征，然后在无菌操作台上进行纯化。用规格为6 mm打孔器选取菌落，转接于新的培养基上，在20℃左右的恒温箱内进行纯化培养，日后观察菌落生长情况[8]。
3 梯度稀释涂板法分离拮抗细菌
土壤悬浮液制备：
a 称取研细的土样1g，倒入试管中，加入无菌水定容至10ml，充分振荡10分钟，静置待土粒沉淀。
b 9ml灭菌水＋1ml土壤悬浮液，充分混匀，即1/100浓度。
c 依次配制，1/1000浓度。
d 同上，即1/10000浓度。
e 同上，即1/100000浓度。
在稀释时，可在盛有无菌水的试管中加入1滴100g/L的石炭酸溶液，用以抑制细菌生长。
接种方法：d或e土壤溶液，每皿加入20～30μl，用吸管吸0.1ml(2滴)，取用无菌三角玻璃棒涂抹接种。
培养：在28℃下培养3-5天并观察
4 病原菌的鉴定 将分离纯化的病原菌接种到健康的无病辣椒植株上，观察辣椒是否产生与原来青枯病相同的病害，如相同则可进行下一步实验，若不是则需要继续分离提纯。采用伤根淋灌菌液接种法进行接种[9]。
2.2.2 拮抗菌的筛选
1 拮抗菌的分离和初筛 将病原菌接种于液体TTC培养基，30℃、170 r m in- 1振荡培养36 h，离心收集菌体并用无菌水重悬，放置于70%酒精和10% 双氧水消毒的无菌喷瓶里，然后对准无菌TTC平板均匀地喷上病原菌菌悬液，制成含菌平板[10]。晾干后再倒上一层薄薄的NA 培养基，制成双层平板。将土样进行梯度稀释，取10- 4 ~ 10- 8浓度的稀释液涂布双层平板，30℃倒置培养，挑出有拮抗圈的菌落，并点接TTC 平板上，30℃倒置培养24h后，取喷瓶对准平板均匀地喷上病原菌菌悬液，继续30℃倒置培养，选择抑菌圈直径大的菌株。
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