不同稀酸制备gem颗粒比较研究
：GEM（gram-positive enhancer matrix, GEM）颗粒是一种球形的肽聚糖基质，是乳酸乳球菌外壳（GEM）—蛋白锚定系统的主要组成部分。本试验以GEM制备为研究重点，旨在研究不同稀酸处理制备GEM颗粒比较分析。首先选取HCL、TCA与H2SO4三种酸制剂，分别配制不同浓度的稀酸制备GEM颗粒；然后比较不同处理制备的GEM的质量：包括：得率、杂蛋白去除率以及与锚钩蛋白（protein anchor，PA）的亲和活性。此外，本试验还对GEM颗粒的保存期做了初步研究。结果显示：低浓度中浓度TCA制备的GEM颗粒得率、锚定活性较好，但杂蛋白去除效果较差。0.025M的H2SO4与0.1M的HCL可制备高质量的GEM，得率分别为89.8%与86.5%，二者杂蛋白去除率及亲和活性均无明显差异。GEM冻干不影响其锚定活性，4℃保存目前可以到4个月。该结果可为完善乳酸乳球菌外壳—蛋白锚定系统研究，尤其是制备高质量GEM颗粒提供试验依据。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.2实验室概况4
1.3试验步骤与方法4
1.3.1 GM17培养基的配置4
1.3.2不同稀酸制备GEM颗粒4
1.3.3 蛋白浓度分析4
1.3.4 SDSPAGE凝胶电泳5
1.3.5计数 5
1.3.6 GEM颗粒锚定活性分析 5
2 结果与分析5
2.1不同稀酸处理制备GEM颗粒SDSPAGE分析5
2.2不同稀酸处理制备GEM颗粒得率6
2.3不同稀酸制备GEM颗粒杂蛋白去除效率分析7
2.4不同稀酸制备GEM颗粒与PA蛋白锚定活性比较8
2.5不同保存期的GEM颗粒与不同保存条件锚定活性的比较 10
3 讨论10
致谢11
参考文献11
不同稀酸制备GEM颗粒比较分析
引言
荷兰科学家Tjibbe Bos
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
ma等（2006）基于革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌[14]（Lactococcus lactis）所形成的非活性的食品级的外壳颗粒研制成了一种抗原展示系统[5]。即乳酸乳球菌外壳—蛋白锚定系统[67]（ghostprotein anchor system），也叫革兰氏阳性增强基质（grampositive enhancer matrix, GEM）系统。GEM颗粒[8]是将L.lactis用热酸煮沸处理方式制成，去除了核酸及表面的脂磷壁酸等物质，保留了原菌的肽聚糖骨架和形态大小。GEM颗粒作为乳酸乳球菌[910]外壳—蛋白锚定系统的主要组成部分，其制备工艺和质量控制关系到整个系统的成败。目前，GEM的制备及质量控制深入研究国内外均未见报道。本研究拟比较研究不同稀酸处理制备GEM颗粒，从得率、杂蛋白去除率、锚定活性等分析研究，以期为完善乳酸乳球菌外壳—蛋白锚定系统奠定基础。
Gucheng Zeng等（2009）通过近场扫描光学显微镜和原子力学手段证实了抗原可以在GEM颗粒表面高密度的展示，且GEM颗粒因为去除了核酸等物质，免疫后引发的抗载体反应也较小，因此GEM颗粒是一种很有潜力的表面展示平台，具有绝对安全、高密度展示外源蛋白的特性。
现有的研究证明不同稀酸制备GEM颗粒影响不大，pH=1才是制备成功的关键。本文旨在研究不同稀酸制备GEM颗粒，探索出制备高质量GEM颗粒最合适的稀酸。
1 材料与方法
1.1 试验材料
乳酸乳球菌MG1363（江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心提供）
PA蛋白（江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心提供）
1.2 试验室概况
本试验是在江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心进行，本中心具备从事本研究所需的仪器设备和设施条件，其中包括厌氧罐、生物安全柜、PCR仪、荧光显微镜、图像分析系统、紫外分光光度计、酶标仪、粒径分析仪、AKTApurifier蛋白纯化仪等主要相关仪器设备。这些仪器设备可以满足本课题的研究需要。
1.3试验步骤与方法
1. 3. 1 GM17培养基[11]的配置 体系1L：
5g葡萄糖，10g蛋白胨，2.5g牛肉膏，2.5g酵母粉，19gβ磷酸甘油二钠，0.5g抗坏血酸，0.25g七水硫酸镁，加水定容至一升。115℃高压（防止葡萄糖碳化）。加牛肉膏时可将称量纸一并加入容器中，高压后于超净台中取出，防止牛肉膏粘附于称量纸上造成试剂损失，减小试验误差。
1.3.2 不同稀酸制备GEM颗粒
乳酸乳球菌MG1363接种新鲜GM17培养基， 30℃温箱静止培养1620h。乳酸乳球菌MG为厌氧菌，培养时瓶盖保持密封。至菌液浑浊不透明时培养结束。每10ml菌液13000g，10 min离心收集菌体，水洗一遍(2ml水2500g 3min离心)，分别加入8ml 0.2M、0.1M、0.05M、0.025M的HCl；1.2M、0.6M、0.3M、0.015M的TCA；0.1M、0.05M、0.025M、0.0125M的H2SO4重悬（pH=1）于试管中，在电磁炉中沸水浴30 min，煮沸时盖上试管塞避免水分蒸发而导致蛋白浓度结果测定中大的误差。2500g 3min离心收集酸液，沉淀用PBS（2500g3min）洗涤三遍，最后一遍用2ml PBS重悬。
1.3.3 蛋白浓度分析
计数后的菌悬液10000g 3min离心，热酸处理后的上清调pH=7左右，BCA蛋白检测试剂盒（碧云天生物研究所）分析蛋白浓度，防止因pH对蛋白检测试剂盒造成不良影响。沉淀用PBS洗三遍后SDSPAGE凝胶电泳分析（调pH时尽量一次性调好，溶液过酸过碱都会导致蛋白质变性）。
蛋白浓度分析步骤：
标号
稀释液（ul）
BSA
浓度（ug/ml）
A
0
100ul原液
2000
B
40
120ul原液
1500
C
80
80ul原液
1000
D
50
50ul(B)
750
E
60
60ul(C)
500
F
60
60ul(E)
250
G
60
60ul(F)
125
H
80
20ul(G)
25
I
60
0
0
分别取25ul标准品加入微孔板，做两次重复，再按顺序加入25ul样品液，在波长562nm处测吸光值。
1.3.4 SDSPAGE凝胶电泳
100ul样品+25ul 5*Loading Buffer在100℃金属浴10min，12000rpm离心2min，后取10~20ul样品跑蛋白胶。跑浓缩胶电压为80v，30分钟左右，跑分离胶120v，50分钟左右。跑胶时间根据实际情况做具体调整。跑完胶后染色液染色1~2小时，脱色过夜。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.2实验室概况4
1.3试验步骤与方法4
1.3.1 GM17培养基的配置4
1.3.2不同稀酸制备GEM颗粒4
1.3.3 蛋白浓度分析4
1.3.4 SDSPAGE凝胶电泳5
1.3.5计数 5
1.3.6 GEM颗粒锚定活性分析 5
2 结果与分析5
2.1不同稀酸处理制备GEM颗粒SDSPAGE分析5
2.2不同稀酸处理制备GEM颗粒得率6
2.3不同稀酸制备GEM颗粒杂蛋白去除效率分析7
2.4不同稀酸制备GEM颗粒与PA蛋白锚定活性比较8
2.5不同保存期的GEM颗粒与不同保存条件锚定活性的比较 10
3 讨论10
致谢11
参考文献11
不同稀酸制备GEM颗粒比较分析
引言
荷兰科学家Tjibbe Bos
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
ma等（2006）基于革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌[14]（Lactococcus lactis）所形成的非活性的食品级的外壳颗粒研制成了一种抗原展示系统[5]。即乳酸乳球菌外壳—蛋白锚定系统[67]（ghostprotein anchor system），也叫革兰氏阳性增强基质（grampositive enhancer matrix, GEM）系统。GEM颗粒[8]是将L.lactis用热酸煮沸处理方式制成，去除了核酸及表面的脂磷壁酸等物质，保留了原菌的肽聚糖骨架和形态大小。GEM颗粒作为乳酸乳球菌[910]外壳—蛋白锚定系统的主要组成部分，其制备工艺和质量控制关系到整个系统的成败。目前，GEM的制备及质量控制深入研究国内外均未见报道。本研究拟比较研究不同稀酸处理制备GEM颗粒，从得率、杂蛋白去除率、锚定活性等分析研究，以期为完善乳酸乳球菌外壳—蛋白锚定系统奠定基础。
Gucheng Zeng等（2009）通过近场扫描光学显微镜和原子力学手段证实了抗原可以在GEM颗粒表面高密度的展示，且GEM颗粒因为去除了核酸等物质，免疫后引发的抗载体反应也较小，因此GEM颗粒是一种很有潜力的表面展示平台，具有绝对安全、高密度展示外源蛋白的特性。
现有的研究证明不同稀酸制备GEM颗粒影响不大，pH=1才是制备成功的关键。本文旨在研究不同稀酸制备GEM颗粒，探索出制备高质量GEM颗粒最合适的稀酸。
1 材料与方法
1.1 试验材料
乳酸乳球菌MG1363（江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心提供）
PA蛋白（江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心提供）
1.2 试验室概况
本试验是在江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心进行，本中心具备从事本研究所需的仪器设备和设施条件，其中包括厌氧罐、生物安全柜、PCR仪、荧光显微镜、图像分析系统、紫外分光光度计、酶标仪、粒径分析仪、AKTApurifier蛋白纯化仪等主要相关仪器设备。这些仪器设备可以满足本课题的研究需要。
1.3试验步骤与方法
1. 3. 1 GM17培养基[11]的配置 体系1L：
5g葡萄糖，10g蛋白胨，2.5g牛肉膏，2.5g酵母粉，19gβ磷酸甘油二钠，0.5g抗坏血酸，0.25g七水硫酸镁，加水定容至一升。115℃高压（防止葡萄糖碳化）。加牛肉膏时可将称量纸一并加入容器中，高压后于超净台中取出，防止牛肉膏粘附于称量纸上造成试剂损失，减小试验误差。
1.3.2 不同稀酸制备GEM颗粒
乳酸乳球菌MG1363接种新鲜GM17培养基， 30℃温箱静止培养1620h。乳酸乳球菌MG为厌氧菌，培养时瓶盖保持密封。至菌液浑浊不透明时培养结束。每10ml菌液13000g，10 min离心收集菌体，水洗一遍(2ml水2500g 3min离心)，分别加入8ml 0.2M、0.1M、0.05M、0.025M的HCl；1.2M、0.6M、0.3M、0.015M的TCA；0.1M、0.05M、0.025M、0.0125M的H2SO4重悬（pH=1）于试管中，在电磁炉中沸水浴30 min，煮沸时盖上试管塞避免水分蒸发而导致蛋白浓度结果测定中大的误差。2500g 3min离心收集酸液，沉淀用PBS（2500g3min）洗涤三遍，最后一遍用2ml PBS重悬。
1.3.3 蛋白浓度分析
计数后的菌悬液10000g 3min离心，热酸处理后的上清调pH=7左右，BCA蛋白检测试剂盒（碧云天生物研究所）分析蛋白浓度，防止因pH对蛋白检测试剂盒造成不良影响。沉淀用PBS洗三遍后SDSPAGE凝胶电泳分析（调pH时尽量一次性调好，溶液过酸过碱都会导致蛋白质变性）。
蛋白浓度分析步骤：
标号
稀释液（ul）
BSA
浓度（ug/ml）
A
0
100ul原液
2000
B
40
120ul原液
1500
C
80
80ul原液
1000
D
50
50ul(B)
750
E
60
60ul(C)
500
F
60
60ul(E)
250
G
60
60ul(F)
125
H
80
20ul(G)
25
I
60
0
0
分别取25ul标准品加入微孔板，做两次重复，再按顺序加入25ul样品液，在波长562nm处测吸光值。
1.3.4 SDSPAGE凝胶电泳
100ul样品+25ul 5*Loading Buffer在100℃金属浴10min，12000rpm离心2min，后取10~20ul样品跑蛋白胶。跑浓缩胶电压为80v，30分钟左右，跑分离胶120v，50分钟左右。跑胶时间根据实际情况做具体调整。跑完胶后染色液染色1~2小时，脱色过夜。
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