水稻咖啡酰辅酶a氧甲基转移酶基因ccoaomt的克隆与表达分析
： 2Abstract： 2引言： 31．1 材料 41．2 方法 42 结果与分析 72．1 CCoAOMT基因的结构分析 72．2 氨基酸序列比对与系统进化树分析 82．3 CCoAOMT基因克隆及全长验证 92．4 CCoAOMT基因亚细胞定位 92．5 CCoAOMT基因在不同组织中表达特性 102．6 CCoAOMT基因的诱导表达特性 113 讨论 143．1 CCoAOMT基因的结构分析 143．2 CCoAOMT基因的亚细胞定位 153．3 CCoAOMT基因的组织表达 15致谢 15附录A 溶液配方 18附录B T-pMD19载体（Simple）结构图 19附录C GFP载体结构图 20水稻咖啡酰辅酶A-氧-甲基转移酶基因的克隆与表达分析生命科学学院 生命基地112班 刘忆霖：铜（Cu）是植物生长发育所必需的营养元素之一，但其过量时会对植物造成严重的伤害。植物体和其他组织可以通过结合有机配体来调节细胞内的铜水平，金属结合蛋白是有毒金属参与金属胁迫的分子目标。本实验室前期采用2D-PAGE和质谱技术，发现CCoAOMT为铜结合蛋白之一。为进一步探究水稻CCoAOMT基因在Cu胁迫中的功能，本实验克隆获得水稻CCoAOMT基因家族中的OsCOA1和OsCOA20基因，全长分别为783bp、759bp，分别编码260、252个氨基酸。序列分析表明，OsCOA1和OsCOA20基因在单子叶植物中同源性较高。亚细胞定位显示，OsCOA1和OsCOA20主要分布在细胞壁。半定量RT-PCR检测表明，OsCOA1和OsCOA20基因在水稻中各组织中均有表达，其中茎部的表达量最高。RT-PCR分析表明，铜胁迫诱导CCoAOMT基因的表达。
目录
引言
引言
木质素是一种由苯丙氨酸代谢而来的芳香族化合物，这种复杂的异质聚合体是由香豆醇、松柏醇、芥子醇三种单体分别聚合形成的对羟基苯基木质素（H）、紫丁香基木质素（S）、愈创木基木质素（G）聚合形成的[1]。主要存在于次生加厚细胞的细胞壁中，增加植物的硬度和抗压强度，在植物遭遇机械伤害，病原体侵染，代谢胁迫及细胞内部紊乱等生物和非生物胁迫时诱导其活性增加，是植物中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物[2]。
咖啡酰辅酶AO甲基
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
转移酶(CCoAOMT)是一类S腺苷L甲硫氨酸（SAM）甲基转移酶，以咖啡酰辅酶A为底物，将S腺苷甲硫氨酸上的甲基基团转移到木质素单体的苯环碳3位置上，形成阿魏酰辅酶A，是木质素生物合成途径中一类关键的甲基化酶[3]。甲基化程度的不同区别了木质素的3种单体，从而聚合形成不同致密程度的木质素类型[4]，因此研究CCoAOMT基因对于深入了解植物甲基化途径发生的分子机制具有重要意义。
近年来，随着人口快速增长,工业生产规模不断扩大、城镇化快速发展、农业生产大量施用化肥农药以及污水灌溉等,导致许多有害物质进入土壤系统, 土壤重金属污染已成为全球面临的一个严重环境问题。铜（Cu）是植物的必需营养元素，同时也是重要的环境污染物之一。当Cu在生物体内积累超过一定量时，就会阻碍一系列生理过程，如光合作用、色素合成、氮代谢、膜完整性和矿质吸收。生物体在适应环境的过程中，逐渐形成了一系列的耐受机制，即植物的避逆性和抗逆性。
植物体和其他组织形成了一些机制来调节细胞内的铜水平，这些机制包括两种：一种是调节铜的吸收，另一种是结合有机配体如有机酸、多肽和蛋白质，使细胞内游离铜的浓度最小化。因此，金属结合蛋白是有毒金属参与金属胁迫的分子目标，筛选出金属结合蛋白对于研究有毒金属引起的金属蛋白相互结合有至关重要的作用[5]。
木质素的改变是植物响应生物胁迫和非生物胁迫的一个部分，在机械损伤或病害入侵等外界因子胁迫下，CCoAOMT的活性也会被诱导增加[6]，参与加固细胞壁物质的合成[7]。水稻中鉴定出CCoAOMT对盐胁迫和干旱胁迫起响应[8]；在烟草和拟南芥中同样是干旱胁迫响应基因的一种[9]。当植物遭受非生物逆境，如冷、热、旱、盐害等是，细胞产生大量活性氧，超出自身的清除能力，对细胞的关键组分如蛋白质、质膜和核酸等造成损伤，同事改变细胞的氧化还原状态，通过信号转导途径调节细胞代谢、引发一系列防御响应，导致氧化胁迫[10]。在氧化胁迫中，对于CCoAOMT的表达情况并不清楚。
水稻是世界重要的粮食作物，了解水稻中木质素合成相关基因的表达特征和功能，对于水稻抗病和抗倒伏研究具有积极意义。国内外通过基因克隆等手段对CCoAOMT的研究已取得了一定的进展。CCoAOMT最初由kühnl等[11]和Pakusch等[6]分别在胡萝卜和欧芹的细胞悬浮培养中发现，其cDNA在1991年由Schmitt等[12]首次克隆成功。在百日草中存在5至10种CCoAOMT[13]，烟草中分离有4种CCoAOMT基因[14]。除此之外，在水稻、拟南芥、杨树、棉花等多种植物中先后都发现了多种CCoAOMT基因[15][17]。因此，CCoAOMT存在多基因家族现象，可能与木质素不同的生理功能相关。
CCoAOMT的表达存在明显的组织特异性和时期特异性且大多与木质素合成进程相符。Ye等的研究表明CCoAOMT在木质化组织中优先表达[18]。在毛白杨和美洲黑杨中，CCoAOMT在生长的次生木质部中表达水平较高，丰度与木质化进程相符[19]。在水稻组织中，CCoAOMT在木质化程度较高的厚壁组织和维管束中表达较高[20]。CCoAOMT基因参与愈创木基木质素（G）和紫丁香基木质素（S）的生物合成，抑制其表达可以普遍降低植物木质素含量并改变木质素结构。如抑制CCoAOMT表达的转基因杨树中木质素含量降低12％，S/G比值增加11％[4]；这与抑制烟草CCoAOMT表达的分析研究结果一致[21]。通过基因工程手段调节CCoAOMT基因表达可以改变植物体内木质素含量，改变木质素结构，进而影响木质纤维生物质结构与组成，有利于木质纤维生物质资源的能源化利用。
1 材料与方法
1．1 材料
水稻粳稻冬津(Oryza.sativa L.)
1．2 方法
1．2．1植物材料的培养
水稻种子用10% NaClO消毒20min，用去离子水浸种至种子露白，将露白的种子放置漂浮网上避光萌发，其间可用0.5mmol?L1 CaCl2培养催根分化生长[22]。待胚根初步分化后，采用木村B培养液（配方见附录A）。每隔两天更换一次营养液，pH值调至5.5，直至2周左右，幼苗生长到“两叶一心”，使用10μmol?L1 CuSO4、加DMTU进行一天预处理的10μmol?L1 CuSO4以及200μmol?L1 H2O2分别处理 0、0.5、1、3、6、12、24 小时，分别收集水稻幼苗叶、茎、根组织，可取样于液氮中速冻，转存80℃冰箱备用。
1．2．2 CCoAOMT基因克隆
1．2．2．1 水稻总RNA的提取、cDNA第一链的合成
取0.1g水稻叶片，液氮研磨至粉末，使用TAKARA提取RNA试剂盒，提取水稻叶片组织的总RNA。提取的RNA通过电泳检测和超微量分光光度计(One DropTM，OD1000+ Sepctrophotometer)测量浓度、纯度后，使用TAKARA反转录试剂，合成cDNA第一链，20℃保存备用。
1．2．2．2 CCoAOMT基因RTPCR扩增
在水稻基因组网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上查询CCoAOMT的基因编码序列(CDS)，使用Primer Premier 5.0设计特异性引物：
OsCOA1为5’ATGGCCGAGGCGGCGTCG3’和5’TGCCGCCGCGTCAAGTGA3’；OsCOA20为5’ATGACGACCGGCAATGGC3’和5’TGCCGCCGCCTCGTGTGA3’，目的片段长度分别为783bp；759bp，使用之前合成的水稻cDNA作为模板，TAKARA LaTaq（withGC Buffer）作为扩增酶，50μl体系，PCR反应的条件设定如下：94℃，1min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，2min；(30个循环)；72℃，7min。PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
目录
引言
引言
木质素是一种由苯丙氨酸代谢而来的芳香族化合物，这种复杂的异质聚合体是由香豆醇、松柏醇、芥子醇三种单体分别聚合形成的对羟基苯基木质素（H）、紫丁香基木质素（S）、愈创木基木质素（G）聚合形成的[1]。主要存在于次生加厚细胞的细胞壁中，增加植物的硬度和抗压强度，在植物遭遇机械伤害，病原体侵染，代谢胁迫及细胞内部紊乱等生物和非生物胁迫时诱导其活性增加，是植物中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物[2]。
咖啡酰辅酶AO甲基
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
转移酶(CCoAOMT)是一类S腺苷L甲硫氨酸（SAM）甲基转移酶，以咖啡酰辅酶A为底物，将S腺苷甲硫氨酸上的甲基基团转移到木质素单体的苯环碳3位置上，形成阿魏酰辅酶A，是木质素生物合成途径中一类关键的甲基化酶[3]。甲基化程度的不同区别了木质素的3种单体，从而聚合形成不同致密程度的木质素类型[4]，因此研究CCoAOMT基因对于深入了解植物甲基化途径发生的分子机制具有重要意义。
近年来，随着人口快速增长,工业生产规模不断扩大、城镇化快速发展、农业生产大量施用化肥农药以及污水灌溉等,导致许多有害物质进入土壤系统, 土壤重金属污染已成为全球面临的一个严重环境问题。铜（Cu）是植物的必需营养元素，同时也是重要的环境污染物之一。当Cu在生物体内积累超过一定量时，就会阻碍一系列生理过程，如光合作用、色素合成、氮代谢、膜完整性和矿质吸收。生物体在适应环境的过程中，逐渐形成了一系列的耐受机制，即植物的避逆性和抗逆性。
植物体和其他组织形成了一些机制来调节细胞内的铜水平，这些机制包括两种：一种是调节铜的吸收，另一种是结合有机配体如有机酸、多肽和蛋白质，使细胞内游离铜的浓度最小化。因此，金属结合蛋白是有毒金属参与金属胁迫的分子目标，筛选出金属结合蛋白对于研究有毒金属引起的金属蛋白相互结合有至关重要的作用[5]。
木质素的改变是植物响应生物胁迫和非生物胁迫的一个部分，在机械损伤或病害入侵等外界因子胁迫下，CCoAOMT的活性也会被诱导增加[6]，参与加固细胞壁物质的合成[7]。水稻中鉴定出CCoAOMT对盐胁迫和干旱胁迫起响应[8]；在烟草和拟南芥中同样是干旱胁迫响应基因的一种[9]。当植物遭受非生物逆境，如冷、热、旱、盐害等是，细胞产生大量活性氧，超出自身的清除能力，对细胞的关键组分如蛋白质、质膜和核酸等造成损伤，同事改变细胞的氧化还原状态，通过信号转导途径调节细胞代谢、引发一系列防御响应，导致氧化胁迫[10]。在氧化胁迫中，对于CCoAOMT的表达情况并不清楚。
水稻是世界重要的粮食作物，了解水稻中木质素合成相关基因的表达特征和功能，对于水稻抗病和抗倒伏研究具有积极意义。国内外通过基因克隆等手段对CCoAOMT的研究已取得了一定的进展。CCoAOMT最初由kühnl等[11]和Pakusch等[6]分别在胡萝卜和欧芹的细胞悬浮培养中发现，其cDNA在1991年由Schmitt等[12]首次克隆成功。在百日草中存在5至10种CCoAOMT[13]，烟草中分离有4种CCoAOMT基因[14]。除此之外，在水稻、拟南芥、杨树、棉花等多种植物中先后都发现了多种CCoAOMT基因[15][17]。因此，CCoAOMT存在多基因家族现象，可能与木质素不同的生理功能相关。
CCoAOMT的表达存在明显的组织特异性和时期特异性且大多与木质素合成进程相符。Ye等的研究表明CCoAOMT在木质化组织中优先表达[18]。在毛白杨和美洲黑杨中，CCoAOMT在生长的次生木质部中表达水平较高，丰度与木质化进程相符[19]。在水稻组织中，CCoAOMT在木质化程度较高的厚壁组织和维管束中表达较高[20]。CCoAOMT基因参与愈创木基木质素（G）和紫丁香基木质素（S）的生物合成，抑制其表达可以普遍降低植物木质素含量并改变木质素结构。如抑制CCoAOMT表达的转基因杨树中木质素含量降低12％，S/G比值增加11％[4]；这与抑制烟草CCoAOMT表达的分析研究结果一致[21]。通过基因工程手段调节CCoAOMT基因表达可以改变植物体内木质素含量，改变木质素结构，进而影响木质纤维生物质结构与组成，有利于木质纤维生物质资源的能源化利用。
1 材料与方法
1．1 材料
水稻粳稻冬津(Oryza.sativa L.)
1．2 方法
1．2．1植物材料的培养
水稻种子用10% NaClO消毒20min，用去离子水浸种至种子露白，将露白的种子放置漂浮网上避光萌发，其间可用0.5mmol?L1 CaCl2培养催根分化生长[22]。待胚根初步分化后，采用木村B培养液（配方见附录A）。每隔两天更换一次营养液，pH值调至5.5，直至2周左右，幼苗生长到“两叶一心”，使用10μmol?L1 CuSO4、加DMTU进行一天预处理的10μmol?L1 CuSO4以及200μmol?L1 H2O2分别处理 0、0.5、1、3、6、12、24 小时，分别收集水稻幼苗叶、茎、根组织，可取样于液氮中速冻，转存80℃冰箱备用。
1．2．2 CCoAOMT基因克隆
1．2．2．1 水稻总RNA的提取、cDNA第一链的合成
取0.1g水稻叶片，液氮研磨至粉末，使用TAKARA提取RNA试剂盒，提取水稻叶片组织的总RNA。提取的RNA通过电泳检测和超微量分光光度计(One DropTM，OD1000+ Sepctrophotometer)测量浓度、纯度后，使用TAKARA反转录试剂，合成cDNA第一链，20℃保存备用。
1．2．2．2 CCoAOMT基因RTPCR扩增
在水稻基因组网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上查询CCoAOMT的基因编码序列(CDS)，使用Primer Premier 5.0设计特异性引物：
OsCOA1为5’ATGGCCGAGGCGGCGTCG3’和5’TGCCGCCGCGTCAAGTGA3’；OsCOA20为5’ATGACGACCGGCAATGGC3’和5’TGCCGCCGCCTCGTGTGA3’，目的片段长度分别为783bp；759bp，使用之前合成的水稻cDNA作为模板，TAKARA LaTaq（withGC Buffer）作为扩增酶，50μl体系，PCR反应的条件设定如下：94℃，1min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，2min；(30个循环)；72℃，7min。PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
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