水稻msr基因的亚细胞定位及对非生物胁迫的生理响应
：蛋白质中的甲硫氨酸残基容易被氧化形成甲硫氨酸亚砜，而甲硫氨酸亚砜还原酶MSRA、 MSRB和fRMSR能特异性地将其还原。本研究通过基因重组技术，成功构建了水稻OsMSRA2.1和 OsMSRB5基因的瞬时表达载体；并将其通过基因枪导入洋葱表皮细胞。结果显示，OsMSRA2.1和 OsMSRB5主要定位于细胞质和细胞核中。qRT-PCR分析表明， OsMsrA2.1和OsMSRB5基因受甲基紫精（MV）的诱导，上调表达。此外，本实验还鉴定到OsMsrA2.1突变体18株，其中纯合株系3株，杂合株系6株；OsMSRB5突变体10株，杂合体与纯合体各4株。为探究水稻OsMSR基因的功能提供了实验材料。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1. 1. 1 OsMSR亚细胞定位材料 2
1. 1. 2 MV处理水稻材料 2
1. 1. 3 OsMSR突变体鉴定材料 2
1. 2 方法 2
1. 2. 1 亚细胞定位方法 2
1. 2. 2 MV诱导OsMSR基因表达 5
1. 2. 3 突变体鉴定方法 5
2 结果与分析 6
2.1激光共聚焦显微镜观查结果 6
2. 2 氧化胁迫对OsMSRA2.1和OsMSRB5基因表达的影响 7
2．3 OsMSRA2.1和OsMSRB5基因突变体的鉴定 8
2. 3. 1 1E01019.L突变体鉴定 8
2. 3. 2 3D00669.R突变体鉴定 9
2. 3. 3 突变体和野生型表型差异分析 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 10
附录A溶液配方 11
附录B TpMD19载体（Simple）结构图 14
附录C真核生物瞬时表达载体 15
附录D 目的基因BLAST检测 16
水稻MSR基因的亚
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
细胞定位及对非生物胁迫的生理响应
引言
引言
水稻是我国和全世界重要的粮食作物，也是一个重要的单子叶模式植物[1]。非生物氧化胁迫对水稻的生长和发育有着非常重要的影响，在许多地区已成为农业发展的瓶颈。因此进行水稻抗逆性研究，对提高作物对逆境的耐受能力具有重要意义[2]。在逆境胁迫下，植物细胞产生并积累大量的活性氧，如果活性氧的产生与清除无法达到平衡，超出植物清除活性氧的能力时，将发生氧化胁迫[3]，从而。导致甲硫氨酸被氧化成甲硫氨酸亚砜(MetSO)。氧化产物具有手性，以镜像对映体的形式(MetSSO and MetRSO)混合存在。蛋白表面的甲硫氨酸被氧化后会对细胞造成一系列损伤并最终加速衰老过程。然而，细胞内存在甲硫氨酸亚砜还原酶(methionineSsulfoxide reductase,Msr)，能够用硫氧还蛋白Trx提供的电子,还原被氧化生成的甲硫氨酸亚砜，使之重新变成甲硫氨酸。?到目前为止，一共有三个甲硫氨酸亚砜还原酶家族被报道(MsrA、MsrB、fRMsr)。MsrA和MsrB是最先被发现的两个家族,对底物有手性要求，分别能还原MetSSO和MetRSO。他们不但能够还原游离状态的甲硫氨酸亚砜，还能够还原蛋白表面的甲硫氨酸亚砜。fRMsr家族是直到最近才被发现的，它的特点是只能够还原游离状态的MetRSO，对蛋白表面的MetRSO则无能为力[45]。本实验拟通过对OsMSR突变体水稻进行鉴定及分析，通过与野生型水稻进行分子及生理水平的实验分析。对OsMSRA2.1 、OsMSRB5两种甲硫氨酸亚砜还原酶基因进行亚细胞定位。以便进一步探究这些基因在生物氧化胁迫中的具体作用和发挥功能的机制。
1 材料与方法
1．1 材料
1. 1. 1 OsMSR亚细胞定位材料
水稻种子用10%次氯酸钠溶液在暗处浸泡消毒20min，再用去离子水浸泡一夜后播种。本实验水稻采用木村B营养液(见附录表A)于生科楼一楼水稻房进行培养，换水频率保持为2日一次，水稻生长室温度保持在30℃。
基因枪实验前购置新鲜洋葱备用。
1. 1. 2 MV处理水稻材料
水稻种植方法见1. 1. 1
1. 1. 3 OsMSR突变体鉴定材料
实验中所需的水稻突变体种子于RiceGE (http://signal.salk.edu/cgibin/RiceGE)购买得到。利用RiceGE检索OsMSRA2.1（LOC_Os04g40600）和OsMSRB5（LOC_Os03g24600）的LOC号查找对应突变体水稻，经选择确定编号1E01019.L和3D00669.R分别作为OsMSRA2.1突变体水稻和OsMSRB5突变体水稻。
由广州东盛生物科技有限公司购买DNA分子量标准DS2000；自TaKaRa宝生物工程有限公司购买LA TaqDNA聚合酶以及TaqDNA聚合酶；由苏州金唯智生物科技有限公司完成引物合成的步骤。（培养基及所需溶液配方见附录A）
1. 2 方法
1. 2. 1 亚细胞定位方法
1. 2. 1. 1 水稻RNA的提取
本次实验使用试剂盒提取
（1）液氮研磨，加入Buffer RL裂解组织；
（2）加入无水乙醇；
（3）滤液中加1/2体积无水乙醇；
（4）Buffer RWA + Buffer RWB 清洗RNA Spin Column；
（5）DNase I消化基因组DNA；
（6）RNase Free dH2O洗脱RNA；
（7）得到RNA溶液。
（8）保存：用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,70℃分装保存或加入RNase抑制剂。
1. 2. 1. 2 反转录形成cDNA
从水稻中提取出的RNA，，步骤如下：
(1)在Microtube管中配置反应液（成分见表1）。
表1. PCR反应液成分
Dntp Mixture（10mM每份）
1μl
Ollgo Dt Primer(2.5μM)
1μ
Total RNA
5μl
Rnase Free dH2O
至10μl
(2)PCR仪上进行变性、退火反应
(3)离心数秒种使模板RNA/引物等的混合液聚积于Microtube管底
(4)于上述Microtube管中配制反转录（反应液成分见表2）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1. 1. 1 OsMSR亚细胞定位材料 2
1. 1. 2 MV处理水稻材料 2
1. 1. 3 OsMSR突变体鉴定材料 2
1. 2 方法 2
1. 2. 1 亚细胞定位方法 2
1. 2. 2 MV诱导OsMSR基因表达 5
1. 2. 3 突变体鉴定方法 5
2 结果与分析 6
2.1激光共聚焦显微镜观查结果 6
2. 2 氧化胁迫对OsMSRA2.1和OsMSRB5基因表达的影响 7
2．3 OsMSRA2.1和OsMSRB5基因突变体的鉴定 8
2. 3. 1 1E01019.L突变体鉴定 8
2. 3. 2 3D00669.R突变体鉴定 9
2. 3. 3 突变体和野生型表型差异分析 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 10
附录A溶液配方 11
附录B TpMD19载体（Simple）结构图 14
附录C真核生物瞬时表达载体 15
附录D 目的基因BLAST检测 16
水稻MSR基因的亚
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细胞定位及对非生物胁迫的生理响应
引言
引言
水稻是我国和全世界重要的粮食作物，也是一个重要的单子叶模式植物[1]。非生物氧化胁迫对水稻的生长和发育有着非常重要的影响，在许多地区已成为农业发展的瓶颈。因此进行水稻抗逆性研究，对提高作物对逆境的耐受能力具有重要意义[2]。在逆境胁迫下，植物细胞产生并积累大量的活性氧，如果活性氧的产生与清除无法达到平衡，超出植物清除活性氧的能力时，将发生氧化胁迫[3]，从而。导致甲硫氨酸被氧化成甲硫氨酸亚砜(MetSO)。氧化产物具有手性，以镜像对映体的形式(MetSSO and MetRSO)混合存在。蛋白表面的甲硫氨酸被氧化后会对细胞造成一系列损伤并最终加速衰老过程。然而，细胞内存在甲硫氨酸亚砜还原酶(methionineSsulfoxide reductase,Msr)，能够用硫氧还蛋白Trx提供的电子,还原被氧化生成的甲硫氨酸亚砜，使之重新变成甲硫氨酸。?到目前为止，一共有三个甲硫氨酸亚砜还原酶家族被报道(MsrA、MsrB、fRMsr)。MsrA和MsrB是最先被发现的两个家族,对底物有手性要求，分别能还原MetSSO和MetRSO。他们不但能够还原游离状态的甲硫氨酸亚砜，还能够还原蛋白表面的甲硫氨酸亚砜。fRMsr家族是直到最近才被发现的，它的特点是只能够还原游离状态的MetRSO，对蛋白表面的MetRSO则无能为力[45]。本实验拟通过对OsMSR突变体水稻进行鉴定及分析，通过与野生型水稻进行分子及生理水平的实验分析。对OsMSRA2.1 、OsMSRB5两种甲硫氨酸亚砜还原酶基因进行亚细胞定位。以便进一步探究这些基因在生物氧化胁迫中的具体作用和发挥功能的机制。
1 材料与方法
1．1 材料
1. 1. 1 OsMSR亚细胞定位材料
水稻种子用10%次氯酸钠溶液在暗处浸泡消毒20min，再用去离子水浸泡一夜后播种。本实验水稻采用木村B营养液(见附录表A)于生科楼一楼水稻房进行培养，换水频率保持为2日一次，水稻生长室温度保持在30℃。
基因枪实验前购置新鲜洋葱备用。
1. 1. 2 MV处理水稻材料
水稻种植方法见1. 1. 1
1. 1. 3 OsMSR突变体鉴定材料
实验中所需的水稻突变体种子于RiceGE (http://signal.salk.edu/cgibin/RiceGE)购买得到。利用RiceGE检索OsMSRA2.1（LOC_Os04g40600）和OsMSRB5（LOC_Os03g24600）的LOC号查找对应突变体水稻，经选择确定编号1E01019.L和3D00669.R分别作为OsMSRA2.1突变体水稻和OsMSRB5突变体水稻。
由广州东盛生物科技有限公司购买DNA分子量标准DS2000；自TaKaRa宝生物工程有限公司购买LA TaqDNA聚合酶以及TaqDNA聚合酶；由苏州金唯智生物科技有限公司完成引物合成的步骤。（培养基及所需溶液配方见附录A）
1. 2 方法
1. 2. 1 亚细胞定位方法
1. 2. 1. 1 水稻RNA的提取
本次实验使用试剂盒提取
（1）液氮研磨，加入Buffer RL裂解组织；
（2）加入无水乙醇；
（3）滤液中加1/2体积无水乙醇；
（4）Buffer RWA + Buffer RWB 清洗RNA Spin Column；
（5）DNase I消化基因组DNA；
（6）RNase Free dH2O洗脱RNA；
（7）得到RNA溶液。
（8）保存：用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,70℃分装保存或加入RNase抑制剂。
1. 2. 1. 2 反转录形成cDNA
从水稻中提取出的RNA，，步骤如下：
(1)在Microtube管中配置反应液（成分见表1）。
表1. PCR反应液成分
Dntp Mixture（10mM每份）
1μl
Ollgo Dt Primer(2.5μM)
1μ
Total RNA
5μl
Rnase Free dH2O
至10μl
(2)PCR仪上进行变性、退火反应
(3)离心数秒种使模板RNA/引物等的混合液聚积于Microtube管底
(4)于上述Microtube管中配制反转录（反应液成分见表2）。
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