2氨基5氯苯酚双加氧酶基因的克隆表达及酶学性质的研究
：6-氯苯并噁唑酮(CDHB) 被证实是精噁唑禾草灵(FE)在环境中代谢消解的中间产物。本课题组分离一株以CDHB作为唯一碳源生长的菌株Pigmentiphaga sp. DL-8，该菌株经过2-氨基-5-氯苯酚(2A5CP)途径矿化CDHB。 本研究从菌株DL-8中克隆2A5CP代谢基因簇并实现其开环酶基因cbaB1B2在大肠杆菌中的异源表达。2A5CP代谢基因簇位于染色体，全长约15 kb，与已报道的基因簇相似度99%。重组酶rCbaB1B2是由30 kDa和35 kDa两个亚基组成的复合体，其转化2A5CP的产物为2-氨基-5-氯黏康酸半醛(2A5CMS)，2A5CMS自发形成吡啶环。rCbaB1B2的米氏常数(Km) 和最大反应速率(Vmax)分别为0.92 μM和38.7 μmol·min-1·mg-1。rCbaB1B2最适反应温度和pH值分别为30℃和7.5；该酶对温度和pH极不稳定； Cu2+、Fe3+、Zn2+、Co2+对酶活力有较强的抑制作用；乙腈和CTAB对酶活力有显著激活作用，其余化学试剂不同程度的抑制酶活力。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株、质粒和引物 3
1.1.2 培养基和试剂3
1.2 方法 3
1.2.1 Pigmentiphaga sp. DL8中2A5CP代谢基因(簇)的挖掘3
1.2.2 2A5CP双加氧酶基因cbaB1B2的克隆和重组表达菌株构建4
1.2.3 重组酶CbaB1B2的诱导表达7
1.2.4 CbaB1B2粗酶的亲和层析纯化7
1.2.5 重组酶CbaB1B2的功能验证7
1.2.6 2A5CP双加氧酶CbaB1B2的米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)7
1.2.7 温度和PH值对重组酶CbaB1B2活性和稳定性的影响7
1.2.8 金属离子对重组酶CbaB1B2活性的影响8
1.2.9 有机溶剂、表面活性剂、螯合剂对重组酶CbaB1B2
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活性的影响8
2 结果与分析8
2.1 2A5CP代谢基因簇的挖掘8
2.2 2A5CP双加氧酶基因CbaB1B2的克隆表达和重组表达菌株的构建8
2.3 重组酶CbaB1B2的诱导表达和亲和层析纯化9
2.4 重组酶CbaB1B2的功能验证9
2.5 2A5CP双加氧酶CbaB1B2的米氏常数和最大反应速率10
2.6 pH和温度对重组酶CbaB1B2活性和稳定性的影响10
2.7 金属离子对重组酶CbaB1B2活性的影响11
2.8 有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶CbaB1B2活性的影响12
3 讨论12
致谢13
参考文献13
2氨基5氯苯酚双加氧酶基因的克隆表达及酶学性质的研究
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Abstract 1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株、质粒和引物 3
1.1.2 培养基和试剂3
1.2 方法 3
1.2.1 Pigmentiphaga sp. DL8中2A5CP代谢基因(簇)的挖掘3
1.2.2 2A5CP双加氧酶基因cbaB1B2的克隆和重组表达菌株构建4
1.2.3 重组酶CbaB1B2的诱导表达7
1.2.4 CbaB1B2粗酶的亲和层析纯化7
1.2.5 重组酶CbaB1B2的功能验证7
1.2.6 2A5CP双加氧酶CbaB1B2的米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)7
1.2.7 温度和PH值对重组酶CbaB1B2活性和稳定性的影响7
1.2.8 金属离子对重组酶CbaB1B2活性的影响8
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活性的影响8
2 结果与分析8
2.1 2A5CP代谢基因簇的挖掘8
2.2 2A5CP双加氧酶基因CbaB1B2的克隆表达和重组表达菌株的构建8
2.3 重组酶CbaB1B2的诱导表达和亲和层析纯化9
2.4 重组酶CbaB1B2的功能验证9
2.5 2A5CP双加氧酶CbaB1B2的米氏常数和最大反应速率10
2.6 pH和温度对重组酶CbaB1B2活性和稳定性的影响10
2.7 金属离子对重组酶CbaB1B2活性的影响11
2.8 有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶CbaB1B2活性的影响12
3 讨论12
致谢13
参考文献13
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