拟南芥des1基因的克隆与酵母双杂载体构建
硫化氢（H2S）是新发现的一类气体信号分子，参与植物各类生理反应，能够有效响应逆境胁迫，具有重要研究意义。其中拟南芥Des1基因所编码的半胱氨酸脱巯基酶催化产生H2S，是植物内源产生H2S的重要方式，因而研究DES1与细胞内其他蛋白互作能帮助了解DES1的作用机制和调控方式。本课题通过PCR技术克隆了Des1基因的编码区序列，并利用限制性内切酶与T4连接酶成功构建Des1-pGBKT7融合表达载体；利用热激法将所构载体转化至酵母Y2Hgold感受态，得到能稳定表达DES1的酵母菌株。通过载体构建和酵母转化初步完成酵母双杂交筛选的准备工作，后续需进行酵母自激活验证及杂交筛选等过程得到未知蛋白序列。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料 4
1.1.1植物材料及其培养4
1.1.2菌株及质粒载体4
1.1.3主要试剂5
1.1.4主要仪器设备5
1.2.实验方法 5
1.2.1总RNA的提取5
1.2.2 PCR引物设计5
1.2.3 cDNA的合成6
1.2.4 PCR扩增拟南芥DES1编码区序列6
1.2.5 PCR产物回收6
1.2.6表达载体的构建7
1.2.7大肠杆菌感受态的制备7
1.2.8连接产物的热激转化8
1.2.9菌液PCR验证8
1.2.10 TaKaRa质粒抽提试剂盒提取质粒8
1.2.11酵母感受态的制备与转化9
2结果与分析9
2.1拟南芥Des1基因的克隆和载体构建9
2.2 Des1pGBKT7转化酵母Y2Hgold菌株13
3讨论13
致谢14
参考文献14
拟南芥Des1基因的克隆与酵母双杂载体构建
引言
在一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后，硫化氢（H2S）被证实是第三种气体信号分子。在植物方面，H2S在生长发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
育、种子萌发、气孔运动、延缓衰老以及响应逆境胁迫中发挥着重要作用，并参与机体内必要的生理生化反应[13]。最初H2S被认为是一种工业废气，对生物普遍存在危害作用，高浓度的H2S会损伤细胞线粒体内的细胞色素C氧化酶，从而减弱呼吸作用，影响机体的正常运作，有相关研究发现25 μmol/L H2S即可使细胞线粒体呼吸作用强度降低一半[4]。而后来H2S被发现在动植物体内可通过半胱氨酸代谢产生，并参与机体重要的生命活动，从而成为现代生物学的研究热点之一。
半胱氨酸是许多重要生物分子代谢前体，L半胱氨酸脱巯基酶（Lcysteine desulfhydrase, LCD）和D半胱氨酸脱巯基酶（Dcysteine desulfhydrase, DCD）分别以L/D半胱氨酸为底物产生H2S。本课题研究的拟南芥Des1（AT5G28030）就是L半胱氨酸脱巯基酶的编码基因，该酶位于细胞质且至今未在细胞质发现其他功能相同的酶[5]，同时DES1也是O乙酰基L丝氨酸（硫醇）裂解酶（Oacetylserine（thiol）lyase, OASTL）类似蛋白。OASTL酶可以携带还原态硫并将其结合到O乙酰基L丝氨酸（Oacetylserine, OAS）来合成半胱氨酸，该过程是半胱氨酸脱巯基酶脱硫的逆反应[6]。álvarez等[7]将DES1与其他拟南芥OASTL氨基酸序列进行对比发现，OASA1的74到78残基为高度保守序列，形成一个环状结构并能结合还原态硫合成半胱氨酸，但DES1 75位的甘氨酸残基取代了保守序列中的丝氨酸残基。另外，DES1用于与丝氨酸乙酰转移酶相互作用的位点—β8A~β9A曲面环并不保守，存在部分氨基酸序列的变化。而且进一步研究证明，该蛋白质催化L半胱氨酸降解，而不是半胱氨酸的生物合成。DES1对L半胱氨酸的Km值为0.4 mmol/L，而OASTL酶的Km值则为5.2 mmol/L，由酶学数据可知DES1对L半胱氨酸的亲和力较其它OASTL酶高出13倍，这表明DES1对L半胱氨酸具有更高的底物亲和力，参与催化其降解过程。因此，DES1虽然是OASTL类似蛋白，但其本质是L半胱氨酸脱巯基酶，催化L半胱氨酸降解并内源产生H2S。可见DES1在植物的生命活动中起到了重要的作用，但是对于DES1的具体作用形式和调控机制仍不清楚，研究其与机体内其他蛋白的互作能够帮助明确DES1的功能并鉴定未知蛋白，具有重要意义。
本课题所采用的酵母双杂交系统最初是1989年由Fields和Song[8]创立的，用于检测蛋白之间的相互作用，其基于真核生物转录过程中依赖反式转录因子的特点而建立。在真核生物的转录过程中，转录因子通常由两个或两个以上功能独立的结构域组成，酵母中的GAL4转录因子就包括两个功能区域：DNA结合结构域（DNA binding domain, DNABD）和转录激活结构域（activation domain, AD）。DNABD负责结合上游激活序列（upstream activating sequence, UAS），AD则可招募转录复合物，只有两者在空间上靠近时才可重新表现GAL4转录因子活性，从而激活下游报道基因GAL转录表达。因为GAL4转录因子的两个组分可以人为地分离，分离时仍具备各自的功能但不能激活转录。因此我们将DNABD和已知蛋白质DES1（通常称为诱饵蛋白，bait）的编码基因结合构建融合表达载体，再将AD与拟南芥cDNA文库结合构建文库质粒，转化至酵母细胞后利用mating杂交手段，根据报道基因的表达情况在cDNA文库中筛选能与DES1相互作用的未知蛋白，最后测序得到结果[9]。现今基因编辑技术发展迅速，商品化质粒如pGBKT7只需将目的基因连接在正确位置即可，随后配合特定酵母菌株即可完成检测。该技术原理简单，操作方便，高效灵敏，真实准确，能够客观反映生物体内蛋白互作情况，因而被广泛使用[10]。
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料 4
1.1.1植物材料及其培养4
1.1.2菌株及质粒载体4
1.1.3主要试剂5
1.1.4主要仪器设备5
1.2.实验方法 5
1.2.1总RNA的提取5
1.2.2 PCR引物设计5
1.2.3 cDNA的合成6
1.2.4 PCR扩增拟南芥DES1编码区序列6
1.2.5 PCR产物回收6
1.2.6表达载体的构建7
1.2.7大肠杆菌感受态的制备7
1.2.8连接产物的热激转化8
1.2.9菌液PCR验证8
1.2.10 TaKaRa质粒抽提试剂盒提取质粒8
1.2.11酵母感受态的制备与转化9
2结果与分析9
2.1拟南芥Des1基因的克隆和载体构建9
2.2 Des1pGBKT7转化酵母Y2Hgold菌株13
3讨论13
致谢14
参考文献14
拟南芥Des1基因的克隆与酵母双杂载体构建
引言
在一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后，硫化氢（H2S）被证实是第三种气体信号分子。在植物方面，H2S在生长发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
育、种子萌发、气孔运动、延缓衰老以及响应逆境胁迫中发挥着重要作用，并参与机体内必要的生理生化反应[13]。最初H2S被认为是一种工业废气，对生物普遍存在危害作用，高浓度的H2S会损伤细胞线粒体内的细胞色素C氧化酶，从而减弱呼吸作用，影响机体的正常运作，有相关研究发现25 μmol/L H2S即可使细胞线粒体呼吸作用强度降低一半[4]。而后来H2S被发现在动植物体内可通过半胱氨酸代谢产生，并参与机体重要的生命活动，从而成为现代生物学的研究热点之一。
半胱氨酸是许多重要生物分子代谢前体，L半胱氨酸脱巯基酶（Lcysteine desulfhydrase, LCD）和D半胱氨酸脱巯基酶（Dcysteine desulfhydrase, DCD）分别以L/D半胱氨酸为底物产生H2S。本课题研究的拟南芥Des1（AT5G28030）就是L半胱氨酸脱巯基酶的编码基因，该酶位于细胞质且至今未在细胞质发现其他功能相同的酶[5]，同时DES1也是O乙酰基L丝氨酸（硫醇）裂解酶（Oacetylserine（thiol）lyase, OASTL）类似蛋白。OASTL酶可以携带还原态硫并将其结合到O乙酰基L丝氨酸（Oacetylserine, OAS）来合成半胱氨酸，该过程是半胱氨酸脱巯基酶脱硫的逆反应[6]。álvarez等[7]将DES1与其他拟南芥OASTL氨基酸序列进行对比发现，OASA1的74到78残基为高度保守序列，形成一个环状结构并能结合还原态硫合成半胱氨酸，但DES1 75位的甘氨酸残基取代了保守序列中的丝氨酸残基。另外，DES1用于与丝氨酸乙酰转移酶相互作用的位点—β8A~β9A曲面环并不保守，存在部分氨基酸序列的变化。而且进一步研究证明，该蛋白质催化L半胱氨酸降解，而不是半胱氨酸的生物合成。DES1对L半胱氨酸的Km值为0.4 mmol/L，而OASTL酶的Km值则为5.2 mmol/L，由酶学数据可知DES1对L半胱氨酸的亲和力较其它OASTL酶高出13倍，这表明DES1对L半胱氨酸具有更高的底物亲和力，参与催化其降解过程。因此，DES1虽然是OASTL类似蛋白，但其本质是L半胱氨酸脱巯基酶，催化L半胱氨酸降解并内源产生H2S。可见DES1在植物的生命活动中起到了重要的作用，但是对于DES1的具体作用形式和调控机制仍不清楚，研究其与机体内其他蛋白的互作能够帮助明确DES1的功能并鉴定未知蛋白，具有重要意义。
本课题所采用的酵母双杂交系统最初是1989年由Fields和Song[8]创立的，用于检测蛋白之间的相互作用，其基于真核生物转录过程中依赖反式转录因子的特点而建立。在真核生物的转录过程中，转录因子通常由两个或两个以上功能独立的结构域组成，酵母中的GAL4转录因子就包括两个功能区域：DNA结合结构域（DNA binding domain, DNABD）和转录激活结构域（activation domain, AD）。DNABD负责结合上游激活序列（upstream activating sequence, UAS），AD则可招募转录复合物，只有两者在空间上靠近时才可重新表现GAL4转录因子活性，从而激活下游报道基因GAL转录表达。因为GAL4转录因子的两个组分可以人为地分离，分离时仍具备各自的功能但不能激活转录。因此我们将DNABD和已知蛋白质DES1（通常称为诱饵蛋白，bait）的编码基因结合构建融合表达载体，再将AD与拟南芥cDNA文库结合构建文库质粒，转化至酵母细胞后利用mating杂交手段，根据报道基因的表达情况在cDNA文库中筛选能与DES1相互作用的未知蛋白，最后测序得到结果[9]。现今基因编辑技术发展迅速，商品化质粒如pGBKT7只需将目的基因连接在正确位置即可，随后配合特定酵母菌株即可完成检测。该技术原理简单，操作方便，高效灵敏，真实准确，能够客观反映生物体内蛋白互作情况，因而被广泛使用[10]。
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