卡拉胶对食品蛋白质消化性的影响(附件)
卡拉胶是高电荷密度的负电荷多糖，具有可溶性膳食纤维的基本特性，常用作食品添加剂。在食品大分子（蛋白质、糖类和油脂）中，蛋白质增加饱腹感的能力最强。在胃环境下，带负电的卡拉胶能与带正电的乳清蛋白相互作用，形成的凝胶复合物，从而表现出结构性质上的差异。本项目研究了胃环境诱导下卡拉胶—食用蛋白（如乳清蛋白）复合物的凝胶形成及其结构性质。通过SDS-PAGE电泳，研究了凝胶在胃液中的消化情况，结果显示蛋白质的消化能被延迟，而且随着生物高分子质量比增加延迟性会增强；通过流变的测定研究了凝胶的强度；通过扫描电镜研究了凝胶的微观结构，同样也是用来确认凝胶的形成能够延缓食用蛋白的消化性的机理。关键字卡拉胶 食品蛋白 胃内凝胶 胃内消化Advance on the effects of carrageenan on food protein digestibilityStudent majoring in Bioengineering Qimeng Cai Tutor Bing Hu Abstract: Carrageenan is a negatively charged polysaccharide with high charge densities, it has basic characteristics of soluble dietary fiber, commonly used as a food additive. In food macromolecules (proteins, sugars, and fats), proteins have the strongest ability to increase satiety. In the stomach environment, Carrageenan were heated together with whey protein isolate (SPI) at different biopolymer ratios, induce the change of structure of protein. Stronger gel is formed under higher biopolymer ratios. This project is studied in gelation between f *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
ood protein (e.g. whey protein)-carrageenan (with high negative charge) under simulated gastric conditions and the structural properties of complex gelation. SDS-PAGE results show the digestibility of food protein is delayed after incorporation with the polysaccharides, which is enhanced with the increase of the biopolymer mass ratios. The aim of the rheological properties is the determination of gel strength. The microstructure of carrageenan-protein gel before and after simulated stomach digestion was characterized by scanning electron microscope (SEM), which also confirms that the gel delays the digestion of food protein.引言 卡拉胶（Carrageenan），又称为麒麟菜胶、石花菜胶、鹿角菜胶、角叉菜胶，卡拉胶是从麒麟菜、石花菜、鹿角菜等红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，即它可溶于水中形成稳定性的溶液。它的化学结构是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐[1]。卡拉胶具有可溶性膳食纤维的基本特性，在体内被降解后，卡拉胶能与人体内的血纤维蛋白形成可溶性的络合物。基于卡拉胶具有的性质，在食品工业生产中通常可用作增稠剂、胶凝剂、悬浮剂、乳化剂、成型剂和稳定剂等[2]。除此之外，卡拉胶有一重要的性质是能与蛋白质产生强烈的交互作用和乳化稳定作用，两者的交互作用可提高蛋白质的构象稳定性、乳化特性、凝胶能力、溶解性和粘度等特性[3]，还能增加食物食用时的口感[4]。近些年，由于肥胖和食物过敏等与饮食相关的疾病增加，科研工作者对提高胃肠消化蛋白质的机制这一课题的兴趣也逐渐增加。据报道,蛋白质是所有微量营养物质中最能增加饱腹感，这可用于体重管理和控制肥胖[5-7]。摄入的食物唤起胃肠道饱腹感有两种方法，即机械刺激和体液刺激[8]。食物的消化速度决定其在胃肠道内营养的可用性，这是由于释放激素信号引起的感觉和反应，延迟胃排空可能会引起饱腹感[9]。因此，某种食物的饱腹感增强可以通过减缓释放率来控制。通过改变蛋白质易接近的酶裂解位点来控制蛋白质的消化率[10-12]。通过与食物中的其他成分结合，蛋白质的结构能够变得更加复杂，比如膳食纤维[13-15]。由于膳食纤维其独特的化学和物理特性，本身即是饱腹剂，增厚过程总是与延长胃排空、减慢物质通过小肠的运输时间有关。一般情况下，一些粘性的纤维在胃内不能形成块状，而当其他食物纤维在比临界浓度更高时，在胃内能形成块状，产生较大的体积延缓胃排空[16]。而卡拉胶具有可食性膳食纤维的基本特性，在胃环境中，能与蛋白质产生相互作用，通过自组装反应集合，形成胃内凝胶。卡拉胶将蛋白质包裹在凝胶内部，胃蛋白酶无法直接接触到，很好的保护了蛋白质，即很好地控制食物在胃内的消化率，而且对享受食物没有不利影响。我们目前的实验结果表明，在高卡拉胶浓度下，蛋白质和卡拉胶的混合物能够形成胃内凝胶，尽管目前尚未观察到生物高聚物凝胶系统[17]。能形成胃内凝胶的液体比常规液体在胃里需要更长的运输时间。因此, 在模拟胃环境内产生的溶胶到凝胶转变显著延迟了蛋白质的消化率，可被用于延缓胃排空和促进饱腹感。蛋白质和卡拉胶之间的络合发生在接近或低于蛋白质等电点的pH值环境下。通常是由于带相反电荷的生物大分子之间的静电相互作用[18-19]。静电吸引力的大小在很大程度上取决于相交互大分子的电荷密度[20-22]。胃内凝胶的形成是由于混合物从中性pH值到胃液的酸性pH条件下，带正电荷的蛋白质与带负电荷的卡拉胶之间产生静电相互作用。卡拉胶所带负电荷密度很高，能与蛋白质之间产生很强的吸引力，形成的凝胶强度很大，能十分有效地控制蛋白质的消化，使蛋白质在肠胃内停留时间更长，延缓胃排空，增加饱腹感。本实验中，特地选取乳清蛋白作为研究对象，其具有易消化、蛋白质功效强和利用率高等特性，和卡拉胶相互作用后，对其消化性改变更显著，更好地展现了实验结果[23-25]。1 材料与方法材料 乳清蛋白 卡拉胶 高级纯胃蛋白酶 氯化钠 盐酸1.2 实验方法1.2.1加热乳清分离蛋白和卡拉胶混合液乳清蛋白纯溶液配置使用蒸馏水溶解乳清蛋白在室温下搅拌过夜。根据卡拉胶良好的溶解度采用1%浓度，用蒸馏水溶解在室温下搅拌3小时。蛋白质和卡拉胶混合液被保存在冰箱里(4℃)放置过夜（至少4小时）进行水化作用。乳清蛋白和卡拉胶混合液是用8%浓度的蛋白质溶液分别和不同浓度的卡拉胶溶液等体积混合，其卡拉胶与蛋白质质量比分别为0.025、0.05、0.75和0.1。将混合物的pH值调整到7.0。混合物在85 ℃下水浴30分钟，然后用冷水浴冷却至室温。1.2.2卡拉胶—蛋白质复合物的结构表现以及消化情况1.2.2.1卡拉胶—蛋白质复合物加入到模拟胃液（SGF）中用经过稀释且pH值为1.2的盐酸溶液，加入NaCl使其浓度为0.034mol/L 的混合溶液作为模拟胃液（Simulated gastric fluid, SGF）。冷却后的卡拉胶—乳清蛋白混合液注入到装有SGF的透明玻璃瓶中，混合液体积和SGF体积比为1:1，观察不同质量比的复合物在SGF中的结构变化，并放置黑板做背景进行拍照。1.2.2.2 用胃蛋白酶来消化卡拉胶蛋白复合物经过反复多次试验最终确定合适的胃蛋白酶浓度，胃蛋白酶与蛋白质质量比为1100。消化样品在37℃水浴，90rmp条件下，定时5 10 30 60 90 120分钟时取样，取样前在1.5mL的离心管内加入20μL的浓度为0.5mol/mL的NH4HCO3。同时，卡拉胶—乳清蛋白复合物消化前后分别用扫描电镜进行结构分析。1.2.3 流变特性测定卡拉胶—蛋白质复合物在胃液中消化后的流变特性使用流变仪(Anton Paar, Physica MCR 301, Austria)进行测定。样品处理后的直径约为50mm，厚度大约为2mm。使用100mlL烧杯，用注射器吸取20ml卡拉胶—乳清蛋白混合液注射到20mLSGF中形成一个直径约为50mm的凝胶块，测定前将凝胶块与SGF一起放置于冰箱（4℃）过夜使pH值平衡。次日将凝胶切割成直径为50mm 高为2mm的圆柱体，使样品均匀分布铺满整个板的表面区域。然后在室温25℃下，以1Hz，0.5%应变测定样品的储能模量和损耗模量，表征其成胶强度。1.2.4 SDS-PAGE电泳用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）来分析不同质量比得卡拉胶—乳清蛋白凝胶的消化情况的变化。制备5%的浓缩胶和12%的分离胶。使用的仪器为Bio-Rad Miniprotein 3 unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)，上样样品在加入电泳槽之前在95℃下加热十分钟，然后在1350rmp下离心十秒钟后用移液枪吸取10μL进行上样，其中marker上样量为5μL。电泳结束后，在摇床转速50-60rmp下，使用考马斯亮蓝染色R250在乙酸:甲醇:水(1:5:4)染色溶液中进行染色，用乙酸:甲醇:水(1:3:8)配置的脱色液进行脱色处理。用凝胶成像系统 (Clinx Science Instruments, Shanghai, China)拍电泳凝胶照片。1.2.5 扫描电镜将卡拉胶—乳清蛋白混合液加入到SGF中形成的凝胶，放入NaOH溶液保持变量唯一，保持最初的凝胶微观结构。同样方法制作凝胶，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1:100，消化1小时。将NaOH溶液对已经消化了1小时的凝胶进行失活处理。将凝胶样品用双面刀片切成面积≤6×6mm2，厚度≤2mm的薄片。用合适的清洗液反复清洗样品表明的灰尘、蜡质层、杂质等附着物。两个经过上述处理后的凝胶标本在40℃下放置在2.5%戊二醛中过夜处理。用0.1mol磷酸缓冲液每隔10min冲洗一次，一共进行三次。洗涤凝胶样品使用50%、70%、80%、90%浓度的乙醇水溶液进行脱水处理，脱水时间为15min，100%乙醇脱水3次，每次30min。用叔丁醇置换3次，每次30分钟。用冷冻干燥仪干燥表面。脱水样本达到干燥临界点后使用Sputter Coater (EMS575X, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)进行扫描电镜分析。使用加速电压为15KV的SEM (S-3000, Hitachi Science System Ltd., Hitachinaka, Japan)进行扫描，观察结果。获得放大一定倍数的数码显微图。2 结果与分析2.1模拟胃环境下诱导凝胶形成相同浓度的乳清蛋白与不同浓度的卡拉胶，按照同等体积混合，形成不同质量比的混合液。在85℃下，水浴30分钟后，冷却至室温（25℃），注入装有模拟胃液（SGF,pH1.2）的透明玻璃瓶中以展示凝胶在胃液中的形态。凝胶形成结果如图1所示。从图中可以看出第一，对于质量比最低（0.025:1）的卡拉胶—乳清蛋白混合物，注入SGF后，无法观察到胃内凝胶的形成；当质量比增加到0.05:1时，会在SGF中形成团状物。随着质量比的增加，混合物立刻在SGF中更大范围地形成凝胶。第二，所形成凝胶的强度与生物大分子的质量比有关，质量比越大，凝胶成形越好，强度越高。在广泛的pH范围内，卡拉胶都带负电，而且由于羧基的质子化作用，溶液的pH会对它的电荷密度产生显著的影响。当环境pH从7.0减少到2.0时，卡拉胶会减少大量的负电荷，但是在酸性条件下，卡拉胶仍然是带负电荷。卡拉胶是一种从红藻中提取的硫酸多糖，由于带有硫酸基团，卡拉胶具有强电解质性质。根据硫酸基团的不同，卡拉胶可以被分为K型（Kappa）、I型（Iota）和L型（Lambda）。卡拉胶是典型的带电荷密度的负电荷多糖，有报告指出，其在胃液中所带电荷高于-50 mV。在中性条件下加热时，由于同种电荷的排斥作用，卡拉胶与乳清蛋白的作用很弱。注入SGF后，环境pH低于乳清蛋白的等电点，乳清蛋白变成带正电荷，与带负电荷的多糖产生相互作用，形成凝胶。图1 不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白复合物在SGF中的成胶情况2.2流变性能图2 不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白凝胶的流变特性使用频率扫描测定打入SGF后的卡拉胶-乳清蛋白混合物的流变特性。流变特性实验结果如图2所示，G`表示储能模量，G``表示损耗模量。从图中可以看出第一，在实验所涉及的质量比中，卡拉胶—乳清蛋白复合物都表现出了凝胶性质，即G`都比G``高。在实验所用的频率范围内，样品的的G`和G``都展现出了弱的频率依赖性。第二，凝胶复合物的弹性随质量比的增大而增大。由此可知，高浓度卡拉胶可以促进乳清蛋白和卡拉胶之间的交联程度，增大凝胶强度。第三，卡拉胶—乳清蛋白的凝胶弹性很强，因为卡拉胶拥有很高的电荷密度，同蛋白质之间产生了很强的相互作用。该流变结果与图1中结果有出入。用肉眼观察可以看出，图1中质量比为0.025凝胶样品没有形成凝胶，仍为溶液状态。可能是由于流变样品被放置在4℃的冰箱过夜，进行水化作用，促进凝胶的形成，但是凝胶强度很弱，所以在流变测定的时候会显示出微弱的凝胶特性。对于所有的胶体样品，G`和G``所表现出的低频率都在频率范围内。而且，对于卡拉胶—乳清蛋白，储能模量随质量比而增加，表示高浓度的卡拉胶可以提高与蛋白质间的联结作用，因此可以增加凝胶的强度。2.3 胃内凝胶形成过程图3 卡拉胶和乳清蛋白形成的胃内凝胶形成过程示意图图3为蛋白质和高电荷密度的卡拉胶形成的胃内凝胶过程的示意图。中性pH环境下，蛋白质分子展开，和卡拉胶经过热处理形成更大的聚合物。当卡拉胶—蛋白质混合物溶液打入SGF中，其环境pH远低于蛋白质的等电点，蛋白质立刻带相反的电荷。蛋白质电荷瞬间的反转使生物大分子之间产生联结。混合物中带负电荷的卡拉胶打入SGF中，仍带负电荷。因此，卡拉胶羧基和蛋白质氨基之间的静电相互作用能产生生物大分子内部联结。卡拉胶和蛋白质在低质量比条件下无法形成凝胶网络，质量比越高，卡拉胶和蛋白质之间的联结会越强，以致于，生物大分子内相互吸引形成凝胶网络结构。可以预断，质量比越高，生物大分子间相互作用越强，能形成更强的凝胶。2.4 SDS-PAGE电泳用胃蛋白酶消化乳清蛋白和卡拉胶—乳清蛋白凝胶复合物的电泳结果如图4和图5所示。图4显示了乳清蛋白在SGF中的消化情况。图中，第二道是酶，第三道是未消化的乳清蛋白的条带。对比marker，乳清蛋白的条带有乳铁蛋白（LF）；血清白蛋白（BSA）；β-乳球蛋白（β-LG）；α-乳白蛋白（α-LA）和酪蛋白糖巨肽（CGMP）。在2小时消化过程中，消化开始5分钟后出现分子量较小的致密条带，乳清蛋白亚基条带逐渐消失。而分子量在70kDa左右的肽段是乳清蛋白的亚基，随着时间的推移，条带越来越淡，甚至逐渐消失。分子量在15kDa左右的多肽是乳清蛋白的消化产物，随着时间的推移，条带越来越深，说明胃蛋白酶在对其不断地消化分解成分子量更小的多肽。消化进行到60分钟后，分子量在25kDa-15kDa的多肽在逐渐变少，说明由于消化的持续进行，原先消化出的分子量较大的多肽被消化成了分子量更小的多肽。该乳清蛋白主要由α-乳白蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白（β-LG）组成。胃蛋白酶对乳清蛋白的分解作用不明显（消化时间达到2 h 时仍未出现明显降解）。众所周知，蛋白质的消化率取决于蛋白质的变性程度。乳清蛋白加热之后，蛋白质的三维结构被打开，肽键暴露，增加对胃蛋白酶的敏感性。加热之后仍保留原始状态的乳清蛋白对胃蛋白酶有抵抗性。以实验中使用的蛋白酶比例（1:100）下，使用酶活为1:3000的胃蛋白酶，变性的蛋白质在消化5分钟的时候就开始逐渐消化成较小的多肽。随着消化的进行，乳清蛋白亚基逐渐减少，较小的多肽也逐渐被消化，小的多肽逐渐增加，表示消化在持续进行。图4 乳清蛋白SGF中用胃蛋白酶消化情况 第1道marker; 2, 胃蛋白酶; 3, 乳清蛋白； 4–9道消化5, 10, 30, 60, 90,和 120 分钟后的蛋白图5显示了不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白凝胶复合物的消化情况。从图中可以看出，凝胶复合物的消化情况明显受质量比的影响。与卡拉胶结合之后，乳清蛋白亚基的条带消失了，原因是乳清蛋白的亚基被包裹在凝胶内，而不是游离在SGF中，卡拉胶的存在阻止了胃蛋白酶对蛋白质的接触，胃蛋白酶只能消化游离在SGF中和凝胶表面的蛋白质，而包裹在内部的蛋白质无法被消化。随着时间推移，肽带颜色加深，说明消化持续进行。与纯乳清蛋白的电泳图谱比较可以看出，卡拉胶—乳清蛋白复合物的消化条带随着消化的进行持续加深，并没有出现条带消失的情况。在进一步的消化实验中，具有较强的热稳定性的β-Lg 的持续存在，表示β-lg对胃蛋白酶的消化有抵抗性。从质量比为0.025的凝胶电泳结果看出，即使质量比很低，卡拉胶与乳清蛋白的结合也可以延迟乳清蛋白的消化。质量比高的凝胶复合物延迟乳清蛋白消化的效果更显著。质量比（0.075和0.1）高的两种凝胶复合物，与质量比较低的凝胶相比，随着消化的进行，90分钟和120分钟的时候，消化出来的小分子多肽的条带比较浅，说明消化后期凝胶中没有乳清蛋白被胃蛋白酶分解出来，仍然很好地包裹在凝胶内部，有效地延缓了胃蛋白酶对其的消化，而且消化速率明显在降低。在低质量比（0.025和0.05）的凝胶的电泳结果里出现的分子量大于20kDa的肽片段，然而在高质量比（0.075和0.1）的凝胶的电泳结果里消失了，这是由于质量比高的凝胶内，蛋白质被更好地包裹在凝胶里，胃蛋白酶与肽键的接触减少。卡拉胶和蛋白质结合形成凝胶复合物，明显减缓蛋白质的消化速率，质量比对减缓程度有明显的影响。尽管在中性的加热条件下，负电荷互相排斥，带负电荷卡拉胶与蛋白质的结合很微弱，但将经热处理的高分子复合物注入SGF之后，环境pH低于蛋白质的pI，蛋白质变成带正电荷，能与带负电荷卡拉胶结合。即使在质量比为0.025时，蛋白质的消化已经被抑制了。以往很多研究也阐述过类似的现象，带负电荷的卡拉胶可以与蛋白质发生相互作用从而降低蛋白质的消化性。凝胶强度能影响凝胶的消化率，而高质量比的凝胶复合物可以明显增强凝胶的强度。高浓度的卡拉胶中，有足够多的卡拉胶与蛋白质分子交联，从而形成十分紧密的网络结构，将蛋白质包裹在内，减少蛋白酶与肽键的接触，只有凝胶表面的蛋白可以与蛋白酶接触。同时，凝胶表面蛋白质的敏感性也有可能因为卡拉胶的交联作用而减弱。卡拉胶与蛋白质结合的机理是静电相互作用。卡拉胶本身带高密度的负电荷，在胃环境的pH条件下仍带负电荷。乳清蛋白本身不带电荷，但是当进入胃环境中，其环境pH低于乳清蛋白的等电点，使其带正电荷。在胃环境中，卡拉胶和乳清蛋白带相反电荷，两者之间会发生静电相互作用，彼此之间产生致密的联结。图5 不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白在SGF中用胃蛋白酶消化情况质量比A—0.025:1 B—0.05:1 C—0.075:1 D—0.1:12.5扫描电镜用扫描电镜看高质量比的卡拉胶—乳清蛋白初始样品和消化后的样品的内部网络结构。凝胶的三维网状结构是其理化性质的重要决定因素。图6揭示了初始卡拉胶—乳清蛋白凝胶的微观结构和消化1小时后凝胶的微观结构，样品的质量比均为0.1:1。初始样品的扫描电镜照片的放大倍数为4000倍，消化后的样品为2000倍。从实验结果中，我们可以明显区分出乳清蛋白和卡拉胶—乳清蛋白凝胶的典型特征结构，分别标记为P和M。在扫描电镜呈现中，球型颗粒表示蛋白质聚集，纤维网状表示凝胶复合物。很明显，两者在复合物中表现出了不同的形态。在卡拉胶—乳清蛋白凝胶中，纤维网状结构占主导地位，即主要由卡拉胶—乳清蛋白复合物组成，更倾向于形成纤维网状结构。高浓度的卡拉胶可以形成高强度的凝胶，更多蛋白质被卡拉胶包裹。胃蛋白酶消化1小时后，大部分代表凝胶的微观结构消失了，说明凝胶被分解，但仍有部分残留。与未消化的相比，消化过的凝胶微观结构出现更大的空洞，这些空洞大部分是未与卡拉胶结合的蛋白质被消化后产生的，小部分是凝胶复合物的本来位置，后被胃蛋白酶分解消化。图6的结果中，凝胶内部空洞较多，可能是由于使用NaOH终止反应时，NaOH对凝胶结构有腐蚀性，会溶解凝胶，对最终电镜结果产生了一定程度的影响。图6 质量比为0.1:1的卡拉胶—乳清蛋白的扫描电镜结果A原样 B消化1小时M凝胶复合物为主的纤维网状结构 P蛋白质为主的颗粒网状结构3 讨论 3.1 结果在实验研究中，卡拉胶对蛋白质消化性能产生不容忽视的影响。卡拉胶—乳清蛋白混合物经过热处理后，注入SGF后立刻形成凝胶。通过SDS-PAGE电泳实验，证实了卡拉胶与乳清蛋白之间的相互作用会显著影响蛋白质的消化性，阻止胃蛋白酶对蛋白质的消化分解。根据扫描电镜的结果可知，胃蛋白酶对凝胶是存在消化的，但是经过1小时消化后，大部分蛋白质仍然存在凝胶内，未被消化。卡拉胶对蛋白质消化性的影响，主要取决于卡拉胶—蛋白质的质量比。正如前文结果分析所描述的，使用低浓度卡拉胶（0.2%），卡拉胶对乳清蛋白的消化性没有产生显著的影响。而使用高浓度卡拉胶（0.8%），蛋白质的消化性有明显的改变，显著延缓了蛋白质的消化过程。胃内凝胶的作用机制是当pH降到蛋白质等电点以下，带正电荷的蛋白质和带负电荷的卡拉胶通过静电作用相互吸引发生交联结合。卡拉胶作为常用食品添加剂，拥有膳食纤维的基本特性，在胃肠道环境内，能和蛋白质产生相互作用，诱导凝胶结构自然发生，延缓凝胶复合物内蛋白质的消化。3.2 不足首先，本实验扫描电镜实验结果不完美，所拍出的电镜照片中没有明显展现出代表蛋白质的团状结构，多为代表卡拉胶—乳清蛋白的凝胶纤维网状结构，没有很好地展现出胃蛋白酶对蛋白质的消化，无法很好地通过电镜结果证实凝胶复合物对蛋白质消化性产生的影响。第二，由于实验研究时间的限制，我们原计划进行荧光蛋白标记，探究卡拉胶和蛋白质是如何进行交联的，从微观结构角度看不同浓度卡拉胶和蛋白质的交联方式存在何种差别。3.3 展望食物种类繁多，成分各异。食物中不同成分在胃内产生相互作用，影响彼此的性质，挖掘出新的性质。卡拉胶在食品制造生产中，发挥了越来越多的实际功能，而对于卡拉胶与其他食品成分的反应性机理的研究越来越受到人们的重视和关注。卡拉胶具有膳食纤维的基本特性，在食欲控制和体重管理上所起的作用并不是因为更低的食物能量比重或者因为吸水而增加胃内膨胀，而是通过增加小肠内消化物的黏性，从而延长食物通过小肠的时间和减缓营养物质吸收的速率。虽然蛋白质增加饱腹感的机制尚未完全定义，目前解释为，蛋白质通过减少能量消耗和增加放热作用来增加饱腹感。目前的研究多为关注卡拉胶和蛋白质单独在胃肠道内的消化情况，很少有关注卡拉胶和蛋白质的混合物的物性，特别是两者混合时的相互作用。所以，该研究十分具有创新性，极具研究价值。在该研究中，我们发现卡拉胶—乳清蛋白的混合物的行为表现取决于生物高分子质量比，高卡拉胶—乳清蛋白混合物质量比的样品能形成大量凝胶，该样品中的乳清蛋白表现出低消化速率。关于蛋白质消化性的研究成果对于蛋白质相关饮食非常重要。在胃肠道中，蛋白质和其他成分的相互作用会显著改变蛋白质的消化性。该实验结构表明，经过2小时的消化，胃内凝胶没有完全分解，大多数蛋白质仍在凝胶内。据了解，大食物颗粒在胃内需要更长的保温时间，通过胃内的时间更慢，因为它必须变得足够小以至于通过幽门瓣（隔开胃和小肠的部分）。胃内凝胶状态的食物通过胃肠道需要更长的时间。研究显示卡拉胶和蛋白质的相互作用对蛋白质的消化、增加饱腹感和食物吸收调节有一定影响，能延缓胃排空和增加饱腹感。后续的研究需要分析胃内凝胶是否能增加饱腹感。致谢参考文献[1] 孟娟, 吴广州. 卡拉胶流变学特性及应用研究[J]. 粮食科技与经济, 2012, 37(6): 25-28. 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Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1加热大豆分离蛋白和卡拉胶混合液 2
1.2.2卡拉胶—蛋白复合物的结构表现以及消化情况 2
1.2.2.1卡拉胶—蛋白质复合物加入到模拟胃液（SGF）中 3
1.2.2.2用胃蛋白酶来消化卡拉胶蛋白复合物 3
1.2.3流变特性测定 3
1.2.4 SDSPAGE电泳3
1.2.5扫描电镜 3
2结果与分析 3
2.1模拟胃环境下诱导的凝胶形成 3
2.2流变性能 4
2.3胃内凝胶形成过程5
2.4 SDSPAGE电泳 6
2.5扫描电镜7
3讨论9
3.1结论9
3.2不足9
3.3展望9
致谢 9
参考文献 10
图 1不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白复合物在SGF中的成胶情况4
图 2不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白凝胶的流变特性4
图 3卡拉胶和乳清蛋白形成的胃内凝胶形成过程示意图5
图 4乳清蛋白在SGF中用胃蛋白酶消化情况6
图 5不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白在SGF中用胃蛋白酶消化情况7
图6质量比为0.1:1的卡拉胶—乳清蛋白的扫描电镜结果8 卡拉胶对食品蛋白质消化性的影响
引言
ood protein (e.g. whey protein)-carrageenan (with high negative charge) under simulated gastric conditions and the structural properties of complex gelation. SDS-PAGE results show the digestibility of food protein is delayed after incorporation with the polysaccharides, which is enhanced with the increase of the biopolymer mass ratios. The aim of the rheological properties is the determination of gel strength. The microstructure of carrageenan-protein gel before and after simulated stomach digestion was characterized by scanning electron microscope (SEM), which also confirms that the gel delays the digestion of food protein.引言 卡拉胶（Carrageenan），又称为麒麟菜胶、石花菜胶、鹿角菜胶、角叉菜胶，卡拉胶是从麒麟菜、石花菜、鹿角菜等红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，即它可溶于水中形成稳定性的溶液。它的化学结构是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐[1]。卡拉胶具有可溶性膳食纤维的基本特性，在体内被降解后，卡拉胶能与人体内的血纤维蛋白形成可溶性的络合物。基于卡拉胶具有的性质，在食品工业生产中通常可用作增稠剂、胶凝剂、悬浮剂、乳化剂、成型剂和稳定剂等[2]。除此之外，卡拉胶有一重要的性质是能与蛋白质产生强烈的交互作用和乳化稳定作用，两者的交互作用可提高蛋白质的构象稳定性、乳化特性、凝胶能力、溶解性和粘度等特性[3]，还能增加食物食用时的口感[4]。近些年，由于肥胖和食物过敏等与饮食相关的疾病增加，科研工作者对提高胃肠消化蛋白质的机制这一课题的兴趣也逐渐增加。据报道,蛋白质是所有微量营养物质中最能增加饱腹感，这可用于体重管理和控制肥胖[5-7]。摄入的食物唤起胃肠道饱腹感有两种方法，即机械刺激和体液刺激[8]。食物的消化速度决定其在胃肠道内营养的可用性，这是由于释放激素信号引起的感觉和反应，延迟胃排空可能会引起饱腹感[9]。因此，某种食物的饱腹感增强可以通过减缓释放率来控制。通过改变蛋白质易接近的酶裂解位点来控制蛋白质的消化率[10-12]。通过与食物中的其他成分结合，蛋白质的结构能够变得更加复杂，比如膳食纤维[13-15]。由于膳食纤维其独特的化学和物理特性，本身即是饱腹剂，增厚过程总是与延长胃排空、减慢物质通过小肠的运输时间有关。一般情况下，一些粘性的纤维在胃内不能形成块状，而当其他食物纤维在比临界浓度更高时，在胃内能形成块状，产生较大的体积延缓胃排空[16]。而卡拉胶具有可食性膳食纤维的基本特性，在胃环境中，能与蛋白质产生相互作用，通过自组装反应集合，形成胃内凝胶。卡拉胶将蛋白质包裹在凝胶内部，胃蛋白酶无法直接接触到，很好的保护了蛋白质，即很好地控制食物在胃内的消化率，而且对享受食物没有不利影响。我们目前的实验结果表明，在高卡拉胶浓度下，蛋白质和卡拉胶的混合物能够形成胃内凝胶，尽管目前尚未观察到生物高聚物凝胶系统[17]。能形成胃内凝胶的液体比常规液体在胃里需要更长的运输时间。因此, 在模拟胃环境内产生的溶胶到凝胶转变显著延迟了蛋白质的消化率，可被用于延缓胃排空和促进饱腹感。蛋白质和卡拉胶之间的络合发生在接近或低于蛋白质等电点的pH值环境下。通常是由于带相反电荷的生物大分子之间的静电相互作用[18-19]。静电吸引力的大小在很大程度上取决于相交互大分子的电荷密度[20-22]。胃内凝胶的形成是由于混合物从中性pH值到胃液的酸性pH条件下，带正电荷的蛋白质与带负电荷的卡拉胶之间产生静电相互作用。卡拉胶所带负电荷密度很高，能与蛋白质之间产生很强的吸引力，形成的凝胶强度很大，能十分有效地控制蛋白质的消化，使蛋白质在肠胃内停留时间更长，延缓胃排空，增加饱腹感。本实验中，特地选取乳清蛋白作为研究对象，其具有易消化、蛋白质功效强和利用率高等特性，和卡拉胶相互作用后，对其消化性改变更显著，更好地展现了实验结果[23-25]。1 材料与方法材料 乳清蛋白 卡拉胶 高级纯胃蛋白酶 氯化钠 盐酸1.2 实验方法1.2.1加热乳清分离蛋白和卡拉胶混合液乳清蛋白纯溶液配置使用蒸馏水溶解乳清蛋白在室温下搅拌过夜。根据卡拉胶良好的溶解度采用1%浓度，用蒸馏水溶解在室温下搅拌3小时。蛋白质和卡拉胶混合液被保存在冰箱里(4℃)放置过夜（至少4小时）进行水化作用。乳清蛋白和卡拉胶混合液是用8%浓度的蛋白质溶液分别和不同浓度的卡拉胶溶液等体积混合，其卡拉胶与蛋白质质量比分别为0.025、0.05、0.75和0.1。将混合物的pH值调整到7.0。混合物在85 ℃下水浴30分钟，然后用冷水浴冷却至室温。1.2.2卡拉胶—蛋白质复合物的结构表现以及消化情况1.2.2.1卡拉胶—蛋白质复合物加入到模拟胃液（SGF）中用经过稀释且pH值为1.2的盐酸溶液，加入NaCl使其浓度为0.034mol/L 的混合溶液作为模拟胃液（Simulated gastric fluid, SGF）。冷却后的卡拉胶—乳清蛋白混合液注入到装有SGF的透明玻璃瓶中，混合液体积和SGF体积比为1:1，观察不同质量比的复合物在SGF中的结构变化，并放置黑板做背景进行拍照。1.2.2.2 用胃蛋白酶来消化卡拉胶蛋白复合物经过反复多次试验最终确定合适的胃蛋白酶浓度，胃蛋白酶与蛋白质质量比为1100。消化样品在37℃水浴，90rmp条件下，定时5 10 30 60 90 120分钟时取样，取样前在1.5mL的离心管内加入20μL的浓度为0.5mol/mL的NH4HCO3。同时，卡拉胶—乳清蛋白复合物消化前后分别用扫描电镜进行结构分析。1.2.3 流变特性测定卡拉胶—蛋白质复合物在胃液中消化后的流变特性使用流变仪(Anton Paar, Physica MCR 301, Austria)进行测定。样品处理后的直径约为50mm，厚度大约为2mm。使用100mlL烧杯，用注射器吸取20ml卡拉胶—乳清蛋白混合液注射到20mLSGF中形成一个直径约为50mm的凝胶块，测定前将凝胶块与SGF一起放置于冰箱（4℃）过夜使pH值平衡。次日将凝胶切割成直径为50mm 高为2mm的圆柱体，使样品均匀分布铺满整个板的表面区域。然后在室温25℃下，以1Hz，0.5%应变测定样品的储能模量和损耗模量，表征其成胶强度。1.2.4 SDS-PAGE电泳用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）来分析不同质量比得卡拉胶—乳清蛋白凝胶的消化情况的变化。制备5%的浓缩胶和12%的分离胶。使用的仪器为Bio-Rad Miniprotein 3 unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)，上样样品在加入电泳槽之前在95℃下加热十分钟，然后在1350rmp下离心十秒钟后用移液枪吸取10μL进行上样，其中marker上样量为5μL。电泳结束后，在摇床转速50-60rmp下，使用考马斯亮蓝染色R250在乙酸:甲醇:水(1:5:4)染色溶液中进行染色，用乙酸:甲醇:水(1:3:8)配置的脱色液进行脱色处理。用凝胶成像系统 (Clinx Science Instruments, Shanghai, China)拍电泳凝胶照片。1.2.5 扫描电镜将卡拉胶—乳清蛋白混合液加入到SGF中形成的凝胶，放入NaOH溶液保持变量唯一，保持最初的凝胶微观结构。同样方法制作凝胶，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1:100，消化1小时。将NaOH溶液对已经消化了1小时的凝胶进行失活处理。将凝胶样品用双面刀片切成面积≤6×6mm2，厚度≤2mm的薄片。用合适的清洗液反复清洗样品表明的灰尘、蜡质层、杂质等附着物。两个经过上述处理后的凝胶标本在40℃下放置在2.5%戊二醛中过夜处理。用0.1mol磷酸缓冲液每隔10min冲洗一次，一共进行三次。洗涤凝胶样品使用50%、70%、80%、90%浓度的乙醇水溶液进行脱水处理，脱水时间为15min，100%乙醇脱水3次，每次30min。用叔丁醇置换3次，每次30分钟。用冷冻干燥仪干燥表面。脱水样本达到干燥临界点后使用Sputter Coater (EMS575X, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)进行扫描电镜分析。使用加速电压为15KV的SEM (S-3000, Hitachi Science System Ltd., Hitachinaka, Japan)进行扫描，观察结果。获得放大一定倍数的数码显微图。2 结果与分析2.1模拟胃环境下诱导凝胶形成相同浓度的乳清蛋白与不同浓度的卡拉胶，按照同等体积混合，形成不同质量比的混合液。在85℃下，水浴30分钟后，冷却至室温（25℃），注入装有模拟胃液（SGF,pH1.2）的透明玻璃瓶中以展示凝胶在胃液中的形态。凝胶形成结果如图1所示。从图中可以看出第一，对于质量比最低（0.025:1）的卡拉胶—乳清蛋白混合物，注入SGF后，无法观察到胃内凝胶的形成；当质量比增加到0.05:1时，会在SGF中形成团状物。随着质量比的增加，混合物立刻在SGF中更大范围地形成凝胶。第二，所形成凝胶的强度与生物大分子的质量比有关，质量比越大，凝胶成形越好，强度越高。在广泛的pH范围内，卡拉胶都带负电，而且由于羧基的质子化作用，溶液的pH会对它的电荷密度产生显著的影响。当环境pH从7.0减少到2.0时，卡拉胶会减少大量的负电荷，但是在酸性条件下，卡拉胶仍然是带负电荷。卡拉胶是一种从红藻中提取的硫酸多糖，由于带有硫酸基团，卡拉胶具有强电解质性质。根据硫酸基团的不同，卡拉胶可以被分为K型（Kappa）、I型（Iota）和L型（Lambda）。卡拉胶是典型的带电荷密度的负电荷多糖，有报告指出，其在胃液中所带电荷高于-50 mV。在中性条件下加热时，由于同种电荷的排斥作用，卡拉胶与乳清蛋白的作用很弱。注入SGF后，环境pH低于乳清蛋白的等电点，乳清蛋白变成带正电荷，与带负电荷的多糖产生相互作用，形成凝胶。图1 不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白复合物在SGF中的成胶情况2.2流变性能图2 不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白凝胶的流变特性使用频率扫描测定打入SGF后的卡拉胶-乳清蛋白混合物的流变特性。流变特性实验结果如图2所示，G`表示储能模量，G``表示损耗模量。从图中可以看出第一，在实验所涉及的质量比中，卡拉胶—乳清蛋白复合物都表现出了凝胶性质，即G`都比G``高。在实验所用的频率范围内，样品的的G`和G``都展现出了弱的频率依赖性。第二，凝胶复合物的弹性随质量比的增大而增大。由此可知，高浓度卡拉胶可以促进乳清蛋白和卡拉胶之间的交联程度，增大凝胶强度。第三，卡拉胶—乳清蛋白的凝胶弹性很强，因为卡拉胶拥有很高的电荷密度，同蛋白质之间产生了很强的相互作用。该流变结果与图1中结果有出入。用肉眼观察可以看出，图1中质量比为0.025凝胶样品没有形成凝胶，仍为溶液状态。可能是由于流变样品被放置在4℃的冰箱过夜，进行水化作用，促进凝胶的形成，但是凝胶强度很弱，所以在流变测定的时候会显示出微弱的凝胶特性。对于所有的胶体样品，G`和G``所表现出的低频率都在频率范围内。而且，对于卡拉胶—乳清蛋白，储能模量随质量比而增加，表示高浓度的卡拉胶可以提高与蛋白质间的联结作用，因此可以增加凝胶的强度。2.3 胃内凝胶形成过程图3 卡拉胶和乳清蛋白形成的胃内凝胶形成过程示意图图3为蛋白质和高电荷密度的卡拉胶形成的胃内凝胶过程的示意图。中性pH环境下，蛋白质分子展开，和卡拉胶经过热处理形成更大的聚合物。当卡拉胶—蛋白质混合物溶液打入SGF中，其环境pH远低于蛋白质的等电点，蛋白质立刻带相反的电荷。蛋白质电荷瞬间的反转使生物大分子之间产生联结。混合物中带负电荷的卡拉胶打入SGF中，仍带负电荷。因此，卡拉胶羧基和蛋白质氨基之间的静电相互作用能产生生物大分子内部联结。卡拉胶和蛋白质在低质量比条件下无法形成凝胶网络，质量比越高，卡拉胶和蛋白质之间的联结会越强，以致于，生物大分子内相互吸引形成凝胶网络结构。可以预断，质量比越高，生物大分子间相互作用越强，能形成更强的凝胶。2.4 SDS-PAGE电泳用胃蛋白酶消化乳清蛋白和卡拉胶—乳清蛋白凝胶复合物的电泳结果如图4和图5所示。图4显示了乳清蛋白在SGF中的消化情况。图中，第二道是酶，第三道是未消化的乳清蛋白的条带。对比marker，乳清蛋白的条带有乳铁蛋白（LF）；血清白蛋白（BSA）；β-乳球蛋白（β-LG）；α-乳白蛋白（α-LA）和酪蛋白糖巨肽（CGMP）。在2小时消化过程中，消化开始5分钟后出现分子量较小的致密条带，乳清蛋白亚基条带逐渐消失。而分子量在70kDa左右的肽段是乳清蛋白的亚基，随着时间的推移，条带越来越淡，甚至逐渐消失。分子量在15kDa左右的多肽是乳清蛋白的消化产物，随着时间的推移，条带越来越深，说明胃蛋白酶在对其不断地消化分解成分子量更小的多肽。消化进行到60分钟后，分子量在25kDa-15kDa的多肽在逐渐变少，说明由于消化的持续进行，原先消化出的分子量较大的多肽被消化成了分子量更小的多肽。该乳清蛋白主要由α-乳白蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白（β-LG）组成。胃蛋白酶对乳清蛋白的分解作用不明显（消化时间达到2 h 时仍未出现明显降解）。众所周知，蛋白质的消化率取决于蛋白质的变性程度。乳清蛋白加热之后，蛋白质的三维结构被打开，肽键暴露，增加对胃蛋白酶的敏感性。加热之后仍保留原始状态的乳清蛋白对胃蛋白酶有抵抗性。以实验中使用的蛋白酶比例（1:100）下，使用酶活为1:3000的胃蛋白酶，变性的蛋白质在消化5分钟的时候就开始逐渐消化成较小的多肽。随着消化的进行，乳清蛋白亚基逐渐减少，较小的多肽也逐渐被消化，小的多肽逐渐增加，表示消化在持续进行。图4 乳清蛋白SGF中用胃蛋白酶消化情况 第1道marker; 2, 胃蛋白酶; 3, 乳清蛋白； 4–9道消化5, 10, 30, 60, 90,和 120 分钟后的蛋白图5显示了不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白凝胶复合物的消化情况。从图中可以看出，凝胶复合物的消化情况明显受质量比的影响。与卡拉胶结合之后，乳清蛋白亚基的条带消失了，原因是乳清蛋白的亚基被包裹在凝胶内，而不是游离在SGF中，卡拉胶的存在阻止了胃蛋白酶对蛋白质的接触，胃蛋白酶只能消化游离在SGF中和凝胶表面的蛋白质，而包裹在内部的蛋白质无法被消化。随着时间推移，肽带颜色加深，说明消化持续进行。与纯乳清蛋白的电泳图谱比较可以看出，卡拉胶—乳清蛋白复合物的消化条带随着消化的进行持续加深，并没有出现条带消失的情况。在进一步的消化实验中，具有较强的热稳定性的β-Lg 的持续存在，表示β-lg对胃蛋白酶的消化有抵抗性。从质量比为0.025的凝胶电泳结果看出，即使质量比很低，卡拉胶与乳清蛋白的结合也可以延迟乳清蛋白的消化。质量比高的凝胶复合物延迟乳清蛋白消化的效果更显著。质量比（0.075和0.1）高的两种凝胶复合物，与质量比较低的凝胶相比，随着消化的进行，90分钟和120分钟的时候，消化出来的小分子多肽的条带比较浅，说明消化后期凝胶中没有乳清蛋白被胃蛋白酶分解出来，仍然很好地包裹在凝胶内部，有效地延缓了胃蛋白酶对其的消化，而且消化速率明显在降低。在低质量比（0.025和0.05）的凝胶的电泳结果里出现的分子量大于20kDa的肽片段，然而在高质量比（0.075和0.1）的凝胶的电泳结果里消失了，这是由于质量比高的凝胶内，蛋白质被更好地包裹在凝胶里，胃蛋白酶与肽键的接触减少。卡拉胶和蛋白质结合形成凝胶复合物，明显减缓蛋白质的消化速率，质量比对减缓程度有明显的影响。尽管在中性的加热条件下，负电荷互相排斥，带负电荷卡拉胶与蛋白质的结合很微弱，但将经热处理的高分子复合物注入SGF之后，环境pH低于蛋白质的pI，蛋白质变成带正电荷，能与带负电荷卡拉胶结合。即使在质量比为0.025时，蛋白质的消化已经被抑制了。以往很多研究也阐述过类似的现象，带负电荷的卡拉胶可以与蛋白质发生相互作用从而降低蛋白质的消化性。凝胶强度能影响凝胶的消化率，而高质量比的凝胶复合物可以明显增强凝胶的强度。高浓度的卡拉胶中，有足够多的卡拉胶与蛋白质分子交联，从而形成十分紧密的网络结构，将蛋白质包裹在内，减少蛋白酶与肽键的接触，只有凝胶表面的蛋白可以与蛋白酶接触。同时，凝胶表面蛋白质的敏感性也有可能因为卡拉胶的交联作用而减弱。卡拉胶与蛋白质结合的机理是静电相互作用。卡拉胶本身带高密度的负电荷，在胃环境的pH条件下仍带负电荷。乳清蛋白本身不带电荷，但是当进入胃环境中，其环境pH低于乳清蛋白的等电点，使其带正电荷。在胃环境中，卡拉胶和乳清蛋白带相反电荷，两者之间会发生静电相互作用，彼此之间产生致密的联结。图5 不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白在SGF中用胃蛋白酶消化情况质量比A—0.025:1 B—0.05:1 C—0.075:1 D—0.1:12.5扫描电镜用扫描电镜看高质量比的卡拉胶—乳清蛋白初始样品和消化后的样品的内部网络结构。凝胶的三维网状结构是其理化性质的重要决定因素。图6揭示了初始卡拉胶—乳清蛋白凝胶的微观结构和消化1小时后凝胶的微观结构，样品的质量比均为0.1:1。初始样品的扫描电镜照片的放大倍数为4000倍，消化后的样品为2000倍。从实验结果中，我们可以明显区分出乳清蛋白和卡拉胶—乳清蛋白凝胶的典型特征结构，分别标记为P和M。在扫描电镜呈现中，球型颗粒表示蛋白质聚集，纤维网状表示凝胶复合物。很明显，两者在复合物中表现出了不同的形态。在卡拉胶—乳清蛋白凝胶中，纤维网状结构占主导地位，即主要由卡拉胶—乳清蛋白复合物组成，更倾向于形成纤维网状结构。高浓度的卡拉胶可以形成高强度的凝胶，更多蛋白质被卡拉胶包裹。胃蛋白酶消化1小时后，大部分代表凝胶的微观结构消失了，说明凝胶被分解，但仍有部分残留。与未消化的相比，消化过的凝胶微观结构出现更大的空洞，这些空洞大部分是未与卡拉胶结合的蛋白质被消化后产生的，小部分是凝胶复合物的本来位置，后被胃蛋白酶分解消化。图6的结果中，凝胶内部空洞较多，可能是由于使用NaOH终止反应时，NaOH对凝胶结构有腐蚀性，会溶解凝胶，对最终电镜结果产生了一定程度的影响。图6 质量比为0.1:1的卡拉胶—乳清蛋白的扫描电镜结果A原样 B消化1小时M凝胶复合物为主的纤维网状结构 P蛋白质为主的颗粒网状结构3 讨论 3.1 结果在实验研究中，卡拉胶对蛋白质消化性能产生不容忽视的影响。卡拉胶—乳清蛋白混合物经过热处理后，注入SGF后立刻形成凝胶。通过SDS-PAGE电泳实验，证实了卡拉胶与乳清蛋白之间的相互作用会显著影响蛋白质的消化性，阻止胃蛋白酶对蛋白质的消化分解。根据扫描电镜的结果可知，胃蛋白酶对凝胶是存在消化的，但是经过1小时消化后，大部分蛋白质仍然存在凝胶内，未被消化。卡拉胶对蛋白质消化性的影响，主要取决于卡拉胶—蛋白质的质量比。正如前文结果分析所描述的，使用低浓度卡拉胶（0.2%），卡拉胶对乳清蛋白的消化性没有产生显著的影响。而使用高浓度卡拉胶（0.8%），蛋白质的消化性有明显的改变，显著延缓了蛋白质的消化过程。胃内凝胶的作用机制是当pH降到蛋白质等电点以下，带正电荷的蛋白质和带负电荷的卡拉胶通过静电作用相互吸引发生交联结合。卡拉胶作为常用食品添加剂，拥有膳食纤维的基本特性，在胃肠道环境内，能和蛋白质产生相互作用，诱导凝胶结构自然发生，延缓凝胶复合物内蛋白质的消化。3.2 不足首先，本实验扫描电镜实验结果不完美，所拍出的电镜照片中没有明显展现出代表蛋白质的团状结构，多为代表卡拉胶—乳清蛋白的凝胶纤维网状结构，没有很好地展现出胃蛋白酶对蛋白质的消化，无法很好地通过电镜结果证实凝胶复合物对蛋白质消化性产生的影响。第二，由于实验研究时间的限制，我们原计划进行荧光蛋白标记，探究卡拉胶和蛋白质是如何进行交联的，从微观结构角度看不同浓度卡拉胶和蛋白质的交联方式存在何种差别。3.3 展望食物种类繁多，成分各异。食物中不同成分在胃内产生相互作用，影响彼此的性质，挖掘出新的性质。卡拉胶在食品制造生产中，发挥了越来越多的实际功能，而对于卡拉胶与其他食品成分的反应性机理的研究越来越受到人们的重视和关注。卡拉胶具有膳食纤维的基本特性，在食欲控制和体重管理上所起的作用并不是因为更低的食物能量比重或者因为吸水而增加胃内膨胀，而是通过增加小肠内消化物的黏性，从而延长食物通过小肠的时间和减缓营养物质吸收的速率。虽然蛋白质增加饱腹感的机制尚未完全定义，目前解释为，蛋白质通过减少能量消耗和增加放热作用来增加饱腹感。目前的研究多为关注卡拉胶和蛋白质单独在胃肠道内的消化情况，很少有关注卡拉胶和蛋白质的混合物的物性，特别是两者混合时的相互作用。所以，该研究十分具有创新性，极具研究价值。在该研究中，我们发现卡拉胶—乳清蛋白的混合物的行为表现取决于生物高分子质量比，高卡拉胶—乳清蛋白混合物质量比的样品能形成大量凝胶，该样品中的乳清蛋白表现出低消化速率。关于蛋白质消化性的研究成果对于蛋白质相关饮食非常重要。在胃肠道中，蛋白质和其他成分的相互作用会显著改变蛋白质的消化性。该实验结构表明，经过2小时的消化，胃内凝胶没有完全分解，大多数蛋白质仍在凝胶内。据了解，大食物颗粒在胃内需要更长的保温时间，通过胃内的时间更慢，因为它必须变得足够小以至于通过幽门瓣（隔开胃和小肠的部分）。胃内凝胶状态的食物通过胃肠道需要更长的时间。研究显示卡拉胶和蛋白质的相互作用对蛋白质的消化、增加饱腹感和食物吸收调节有一定影响，能延缓胃排空和增加饱腹感。后续的研究需要分析胃内凝胶是否能增加饱腹感。致谢参考文献[1] 孟娟, 吴广州. 卡拉胶流变学特性及应用研究[J]. 粮食科技与经济, 2012, 37(6): 25-28. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1加热大豆分离蛋白和卡拉胶混合液 2
1.2.2卡拉胶—蛋白复合物的结构表现以及消化情况 2
1.2.2.1卡拉胶—蛋白质复合物加入到模拟胃液（SGF）中 3
1.2.2.2用胃蛋白酶来消化卡拉胶蛋白复合物 3
1.2.3流变特性测定 3
1.2.4 SDSPAGE电泳3
1.2.5扫描电镜 3
2结果与分析 3
2.1模拟胃环境下诱导的凝胶形成 3
2.2流变性能 4
2.3胃内凝胶形成过程5
2.4 SDSPAGE电泳 6
2.5扫描电镜7
3讨论9
3.1结论9
3.2不足9
3.3展望9
致谢 9
参考文献 10
图 1不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白复合物在SGF中的成胶情况4
图 2不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白凝胶的流变特性4
图 3卡拉胶和乳清蛋白形成的胃内凝胶形成过程示意图5
图 4乳清蛋白在SGF中用胃蛋白酶消化情况6
图 5不同质量比的卡拉胶—乳清蛋白在SGF中用胃蛋白酶消化情况7
图6质量比为0.1:1的卡拉胶—乳清蛋白的扫描电镜结果8 卡拉胶对食品蛋白质消化性的影响
引言
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