β13葡聚糖酶lamc的结晶条件筛选
粘细菌来源的β-1,3-葡聚糖酶LamC具有高效的催化效率和特殊的底物选择性，为单催化结构域的多功能酶，同时N端具有特殊的Fascin-like结构域，该结构域在整个糖苷水解酶家族中的功能目前未知。Ｘ射线晶体衍射是蛋白结构和功能研究的主要方法之一[1]，前提是获得高质量的蛋白晶体。本课题利用pET32a表达载体，Origami2(DE3)大肠杆菌表达宿主，诱导表达LamC，采用镍柱亲和层析和透析浓缩进行蛋白纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白条带单一。采用坐滴气相扩散法，利用蛋白结晶试剂盒筛选LamC的结晶条件，发现在蛋白浓度为6 mg/mL，结晶试剂为0.15 M Potassium bromide，30% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2000，添加剂为0.01 M GSH，0.01 M GSSG，20℃条件下获得了LamC的晶体，为后期获得能够进行X射线衍射的晶体奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
材料与方法2
2.1菌株2
2.2培养基与溶液2
2.3实验器材3
2.4重组酶LamC的诱导表达3
2.5重组酶LamC的纯化3
2.6 重组酶LamC的SDSPAGE检测 3
2.7 重组酶LamC的透析浓缩 4
2.8重组酶LamC浓度检测4
2.9重组酶LamC的结晶 5
3.结果与分析 6
3.1蛋白质纯化及纯度检测 6
3.2蛋白质浓度检测 6
3.3蛋白质结晶条件的初筛7
3.4 蛋白结晶条件的优化 8
4. 讨论 8
致谢 9
参考文献9 β1，3葡聚糖酶LamC的结晶条件筛选
引言
β1,3葡聚糖酶在植物保护、饲料、酿酒、食品和医药工业等领域具有广泛的应用前景[2][3]。课题组前期克隆获得了新型β1,3葡聚糖酶LamC，LamC具有高效的催 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
化效率和特殊的底物选择性。已报道的多功能糖苷水解酶大多由多个催化结构域组成，不同的催化活性由不同的活性中心完成，另一些含有一个催化结构域和一个或多个底物结合域。LamC由N端Fascin结构域和C端GH16催化结构域组成，目前Fascin结构域在整个糖苷水解酶家族中的功能未知，同一催化结构域水解多种底物的催化机理也有待探究。
研究蛋白质的结构对蛋白功能及其机制研究具有重要的意义，结晶是目前研究大分子结构的重要手段之一[4][5]。目前为止，已解析的GH16家族β1,3葡聚糖酶晶体结构有8个，其中文献报道的结构有5个，但LamC催化结构域序列与它们的序列一致性为24.534.5%，表明LamC结构具有新颖性。本课题拟通过蛋白质表达纯化，结晶条件筛选等获得可供X衍射的高质量晶体，为LamC的结构解析和催化机制研究奠定基础。
2. 材料与方法
2.1菌株
用于LamC表达的工程菌株Origami 2（DE3)pET 32alamC。
2.2培养基与溶液
1. LB（LuriaBertani）培养基
5 g/L 酵母浸出物，10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 氯化钠， p H 7.0。121℃，高压蒸汽灭菌 20 min。固体LB培养基则添加15 g/L琼脂。
卡那霉素（Km）
称取卡那霉素5 g，溶于100 ml 水，配成50 mg/mL的母液，过滤除菌，4°C贮存，使用浓度为50 μg/mL。
诱导剂：异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）
称取IPTG 23.8 g，溶于100 ml 水，灭菌水配成1M的母液，过滤除菌，20°C贮存，使用浓度为1 mM.
1.5 M TrisHCl（pH8.8）
称取181.7 g Tris，加约900 mL去离子水揽拌至完全溶解，然后用浓HCl调pH值至8.8，将溶液定容到1000mL后，室温保存。
1M TrisHCl（pH6.8）
称取121.1 g Tris，加入约900 mL去离子水揽拌至完全溶解，然后用浓HCl调pH值至6.8，将溶液定容到1000 mL后，室温保存。
30％Acrylamide
称取丙烯酰胺290g，N,N’亚甲基双丙烯酰胺10g，溶解于800ml去离子水，将溶液定容到1000 mL，用0.45μm滤器过滤后于棕色瓶中保存。
10％（W/V）SDS
称取10g SDS,加入约90 mL去离子水70°C加热溶解，然后用HCl调pH值至7.2，将溶液定容到100 mL，室温保存。
5×SDSPAGE 电极缓冲液
称取Tris粉末15.1g、Glycine（甘氨酸）94g、0.5%(W/V)SDS5.0g，溶解于 800ml 去离子水，搅拌至完全溶解，将溶液定容到1000 mL后，室温保存。
10％（W/V）过硫酸铵
称取1 g过硫酸铵，加入10 mL的去离子水后搅拌溶解。
考马斯亮蓝R250染色液
称取1g考马斯亮蓝250，加入250 mL异丙醇和100 mL冰醋酸搅拌至完全溶解，定容至1000 mL后，用滤纸去除颗粒物质，室温保存。
11．考马斯亮蓝染色脱色液
加入100 mL冰醋酸和50 mL乙醇搅拌至完全溶解，定容到1000 mL，充分混合后使用。
12．2 M咪唑
称取咪唑13.62 g，加入90 mL去离子水完全溶解，浓HCl调pH 7.4，定容至100 mL，0.45μm滤膜过滤除去杂质。用20M TrisHCl（pH7.0）分别稀释成20mM、50mM、100mM、200mM、300mM咪唑，备用。
13. PBS缓冲液
Content concentration（g/L）
NaC l8
KCl 0.2
Na2HPO4 2.9
K2HPO4 0.27
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
材料与方法2
2.1菌株2
2.2培养基与溶液2
2.3实验器材3
2.4重组酶LamC的诱导表达3
2.5重组酶LamC的纯化3
2.6 重组酶LamC的SDSPAGE检测 3
2.7 重组酶LamC的透析浓缩 4
2.8重组酶LamC浓度检测4
2.9重组酶LamC的结晶 5
3.结果与分析 6
3.1蛋白质纯化及纯度检测 6
3.2蛋白质浓度检测 6
3.3蛋白质结晶条件的初筛7
3.4 蛋白结晶条件的优化 8
4. 讨论 8
致谢 9
参考文献9 β1，3葡聚糖酶LamC的结晶条件筛选
引言
β1,3葡聚糖酶在植物保护、饲料、酿酒、食品和医药工业等领域具有广泛的应用前景[2][3]。课题组前期克隆获得了新型β1,3葡聚糖酶LamC，LamC具有高效的催 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
化效率和特殊的底物选择性。已报道的多功能糖苷水解酶大多由多个催化结构域组成，不同的催化活性由不同的活性中心完成，另一些含有一个催化结构域和一个或多个底物结合域。LamC由N端Fascin结构域和C端GH16催化结构域组成，目前Fascin结构域在整个糖苷水解酶家族中的功能未知，同一催化结构域水解多种底物的催化机理也有待探究。
研究蛋白质的结构对蛋白功能及其机制研究具有重要的意义，结晶是目前研究大分子结构的重要手段之一[4][5]。目前为止，已解析的GH16家族β1,3葡聚糖酶晶体结构有8个，其中文献报道的结构有5个，但LamC催化结构域序列与它们的序列一致性为24.534.5%，表明LamC结构具有新颖性。本课题拟通过蛋白质表达纯化，结晶条件筛选等获得可供X衍射的高质量晶体，为LamC的结构解析和催化机制研究奠定基础。
2. 材料与方法
2.1菌株
用于LamC表达的工程菌株Origami 2（DE3)pET 32alamC。
2.2培养基与溶液
1. LB（LuriaBertani）培养基
5 g/L 酵母浸出物，10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 氯化钠， p H 7.0。121℃，高压蒸汽灭菌 20 min。固体LB培养基则添加15 g/L琼脂。
卡那霉素（Km）
称取卡那霉素5 g，溶于100 ml 水，配成50 mg/mL的母液，过滤除菌，4°C贮存，使用浓度为50 μg/mL。
诱导剂：异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）
称取IPTG 23.8 g，溶于100 ml 水，灭菌水配成1M的母液，过滤除菌，20°C贮存，使用浓度为1 mM.
1.5 M TrisHCl（pH8.8）
称取181.7 g Tris，加约900 mL去离子水揽拌至完全溶解，然后用浓HCl调pH值至8.8，将溶液定容到1000mL后，室温保存。
1M TrisHCl（pH6.8）
称取121.1 g Tris，加入约900 mL去离子水揽拌至完全溶解，然后用浓HCl调pH值至6.8，将溶液定容到1000 mL后，室温保存。
30％Acrylamide
称取丙烯酰胺290g，N,N’亚甲基双丙烯酰胺10g，溶解于800ml去离子水，将溶液定容到1000 mL，用0.45μm滤器过滤后于棕色瓶中保存。
10％（W/V）SDS
称取10g SDS,加入约90 mL去离子水70°C加热溶解，然后用HCl调pH值至7.2，将溶液定容到100 mL，室温保存。
5×SDSPAGE 电极缓冲液
称取Tris粉末15.1g、Glycine（甘氨酸）94g、0.5%(W/V)SDS5.0g，溶解于 800ml 去离子水，搅拌至完全溶解，将溶液定容到1000 mL后，室温保存。
10％（W/V）过硫酸铵
称取1 g过硫酸铵，加入10 mL的去离子水后搅拌溶解。
考马斯亮蓝R250染色液
称取1g考马斯亮蓝250，加入250 mL异丙醇和100 mL冰醋酸搅拌至完全溶解，定容至1000 mL后，用滤纸去除颗粒物质，室温保存。
11．考马斯亮蓝染色脱色液
加入100 mL冰醋酸和50 mL乙醇搅拌至完全溶解，定容到1000 mL，充分混合后使用。
12．2 M咪唑
称取咪唑13.62 g，加入90 mL去离子水完全溶解，浓HCl调pH 7.4，定容至100 mL，0.45μm滤膜过滤除去杂质。用20M TrisHCl（pH7.0）分别稀释成20mM、50mM、100mM、200mM、300mM咪唑，备用。
13. PBS缓冲液
Content concentration（g/L）
NaC l8
KCl 0.2
Na2HPO4 2.9
K2HPO4 0.27
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