金针菇原生质体的制备与再生探究
本实验对金针菇原生质体制备与再生的一些影响因子进行探讨，首先探究了5个单因素对金针菇原生质体制备的影响，并且根据上述实验结果设计L9(?34)?的正交试验，探究金针菇原生质体制备的最适条件，并探究了再生培养基的种类对金针菇原生质体再生的影响。实验结果表明，金针菇原生质体形成的最适条件为最适菌龄为6 d，酶系及配比为1%蜗牛酶+1%溶菌酶，酶解温度为25 ℃，酶解时间为2.5 h，渗透压稳定剂为 0.6 mol/L 蔗糖溶液。在此条件下，金针菇原生质体的产量达到最高，为3.68×106个/mL，在RM4为再生培养基的条件下，金针菇的再生率最高，为0. 47 %。关键词 金针菇，原生质体，制备，再生
目 录
1 引言.. 1
1.1 金针菇的形态特征... 1
1.2 金针菇的生长条件... 1
1.3 原生质体的制备和再生2
1.4 金针菇原生质体的制备与再生研究现状4
1.5 选题意义... 5
1.6 发展前景... 5
2 实验材料和方法...... 5
2.1 实验材料、试剂及仪器... 5
2.2 实验方法... 6
3 实验结果分析与讨论...... 9
3.1 金针菇原生质体的形成过程... 9
3.2 菌龄对原生质体制备的影响... 9
3.3 酶种类及配比对原生质体制备的影响..10
3.4 酶解时间对原生质体制备的影响..... 11
3.5 酶解温度对原生质体制备的影响..11
3.6 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响..12
3.7 正交实验结果分析. 13
3.8 再生培养基的种类对原生质体再生的影响..... 13
结论.. 15
致谢.. 16
参考文献.. 17
1 引言
金针菇又称构菌、朴菇、冻菌、毛柄小火菇、冬菇、朴菰、金菇、智力菇等，学名毛柄金钱菌，为伞菌目，口蘑科，金钱菇属，是一种地衣类菌藻，是古今中外著名的食用菌之一。金针菇菌盖滑嫩、菌柄 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
细长脆嫩，形状独特，味道鲜美，营养成分丰富，具有极高的价值，长期以来，受到众多生物学者的关注[1]。为了满足国内外的市场需要，需要改良金针菇菌种，提高金针菇的产量。原生质体融合、诱变选育是有效筛选优良金针菇菌种的方法之一，而原生质体的制备和再生又是原生质体融合、诱变选育的前提。因此，本实验探究了几个因素对金针菇原生质体制备的影响，和再生培养基种类对原生质体再生率的影响，得出金针菇原生质体制备和再生的最适条件。
1．1 金针菇的形态特征
金针菇是小型伞菌目食用菌类，由菌盖、 菌褶、菌柄三部分组成[2]。菌盖幼时成球形，逐渐平展，直径1.57 cm，表面有胶质，菌体中央较厚而边缘较薄，菌褶呈白色或象牙色，担孢子生于菌褶子实层上，较稀疏，长短不一；菌柄中生，呈微微弯曲状。
金针菇一般成束生长，肉质柔软富有弹性。
1．2 金针菇的生长条件
1.2.1 碳氮源
可溶性淀粉和一些糖类物质可作为金针菇生长的碳源。蛋白胨、谷氨酸、尿素可作为金针菇生长的氮源，是金针菇合成蛋白质和核酸所必不可少的重要原料[3]。
1.2.2 空气
金针菇是好氧真菌，需要不断吸收新鲜空气来维持代谢。菌丝生长阶段，需要的空气较少，在子实体形成期需要的空气较多，需要大量通风。CO2是控制金针菇子实体形成和发育的关键因素之一，CO2浓度对金针菇生长发育的影响比其他真菌大，当空气中CO2浓度的积累量超过0.6%时，子实体的形成和菌盖的发育就会受到抑制[4]。
1.2.3 温度
金针菇属低温结实性真菌，其菌丝生长阶段的最适温度为2225 ℃，对高温的抵抗力弱；金针菇子实体分化阶段的最适温度为318 ℃，形成阶段的最适温度为810 ℃；当温度高于12 ℃，不利于金针菇的生长。当昼夜温差大，可刺激菇金针菇子实体原基开始形成[5]。因此通常在早春、秋冬时期栽培。
1.2.4 湿度
金针菇生长对湿度的要求较高。在菌丝生长阶段，需要约65%70%的水分，而在子实体原基形成阶段，需要相对湿度保持在85%左右，在子实体生长阶段，需要相对湿度保持在90%左右。
1.2.5 光照
微弱的光线有助于菌盖的生长。在完全黑暗的条件下，虽然也能生长，但生长速度慢，且形成的菌盖较小，形成畸形菇的可能性大大增加；而光线过强则会抑制菌柄生长，不利于金针菇的生长。
1.2.6 pH
金针菇需要在偏酸性的环境中生长，因此菌丝的最适pH为47，而子实体形成期的最适pH为56[6]。
1．3 原生质体的制备和再生
原生质体融合技术打破了微生物的种界界限，最近几年，受到国内外学者的广泛关注，在生物领域受到极大的重视。要进行原生质体融合，首先要酶解制备大量的原生质体，并使原生质体能按需要稳定高效地再生细胞壁，才能要取得融合的成功[7]。而探索特定菌种原生质体形成和再生的条件，是原生质体技术的关键前提。与细菌、放线菌和酵母的细胞壁相比，真菌的细胞壁更复杂，即使在种类相近的真菌中，细胞壁化学成分的种类和比例也有较大差异[8]。
1.3.1 影响原生质体制备的因素
原生质体的制备率受不同的条件的影响，如年龄、酶浓度、温度、预处理等因素，对原生质体制备有不同的影响。
1.3.1.1菌龄对原生质体制备的影响
菌龄是影响原生质体制备的主要因素之一。在生长初期，菌丝不成熟，因此原生质体数量高；随着菌龄的增加，菌丝趋于成熟，原生质体释放量增加；若菌龄太大，细胞壁结构趋于稳定和老化，不利于酶解反应，原生质体产量显著降低。一般来说，对数生长早期的形成率比较高。
1.3.1.2 酶种类及配比对制备原生质体的影响
用酶法破壁制取原生质体是一种高效的制取方法，其中最关键的是酶。在原生质体制备时，对于不同的微生物，酶解所需的酶种类及配比各不相同，同时酶的纯度、质量等因素对原生质体的形成也有很大影响。由于酶的专一性，不同的酶针对不同的酶解对象。酶用量不同，酶解效果可能会相距甚远：酶的量和浓度太低时，原生质体破壁困难，所以产量不足；酶的量和浓度过高时，杂酶浓度会随之增加，原生质体不稳定，甚至会破裂，产量也会下降。金针菇属于真菌，真菌细胞壁中主要成分为纤维素、 葡聚糖、几丁质、甘露聚糖等，所以金针菇的原生质体制备时当选取具有分解几丁质、纤维素作用的酶时效果比较显著。
1.3.1.3 酶解时间对原生质体制备的影响
目 录
1 引言.. 1
1.1 金针菇的形态特征... 1
1.2 金针菇的生长条件... 1
1.3 原生质体的制备和再生2
1.4 金针菇原生质体的制备与再生研究现状4
1.5 选题意义... 5
1.6 发展前景... 5
2 实验材料和方法...... 5
2.1 实验材料、试剂及仪器... 5
2.2 实验方法... 6
3 实验结果分析与讨论...... 9
3.1 金针菇原生质体的形成过程... 9
3.2 菌龄对原生质体制备的影响... 9
3.3 酶种类及配比对原生质体制备的影响..10
3.4 酶解时间对原生质体制备的影响..... 11
3.5 酶解温度对原生质体制备的影响..11
3.6 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响..12
3.7 正交实验结果分析. 13
3.8 再生培养基的种类对原生质体再生的影响..... 13
结论.. 15
致谢.. 16
参考文献.. 17
1 引言
金针菇又称构菌、朴菇、冻菌、毛柄小火菇、冬菇、朴菰、金菇、智力菇等，学名毛柄金钱菌，为伞菌目，口蘑科，金钱菇属，是一种地衣类菌藻，是古今中外著名的食用菌之一。金针菇菌盖滑嫩、菌柄 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
细长脆嫩，形状独特，味道鲜美，营养成分丰富，具有极高的价值，长期以来，受到众多生物学者的关注[1]。为了满足国内外的市场需要，需要改良金针菇菌种，提高金针菇的产量。原生质体融合、诱变选育是有效筛选优良金针菇菌种的方法之一，而原生质体的制备和再生又是原生质体融合、诱变选育的前提。因此，本实验探究了几个因素对金针菇原生质体制备的影响，和再生培养基种类对原生质体再生率的影响，得出金针菇原生质体制备和再生的最适条件。
1．1 金针菇的形态特征
金针菇是小型伞菌目食用菌类，由菌盖、 菌褶、菌柄三部分组成[2]。菌盖幼时成球形，逐渐平展，直径1.57 cm，表面有胶质，菌体中央较厚而边缘较薄，菌褶呈白色或象牙色，担孢子生于菌褶子实层上，较稀疏，长短不一；菌柄中生，呈微微弯曲状。
金针菇一般成束生长，肉质柔软富有弹性。
1．2 金针菇的生长条件
1.2.1 碳氮源
可溶性淀粉和一些糖类物质可作为金针菇生长的碳源。蛋白胨、谷氨酸、尿素可作为金针菇生长的氮源，是金针菇合成蛋白质和核酸所必不可少的重要原料[3]。
1.2.2 空气
金针菇是好氧真菌，需要不断吸收新鲜空气来维持代谢。菌丝生长阶段，需要的空气较少，在子实体形成期需要的空气较多，需要大量通风。CO2是控制金针菇子实体形成和发育的关键因素之一，CO2浓度对金针菇生长发育的影响比其他真菌大，当空气中CO2浓度的积累量超过0.6%时，子实体的形成和菌盖的发育就会受到抑制[4]。
1.2.3 温度
金针菇属低温结实性真菌，其菌丝生长阶段的最适温度为2225 ℃，对高温的抵抗力弱；金针菇子实体分化阶段的最适温度为318 ℃，形成阶段的最适温度为810 ℃；当温度高于12 ℃，不利于金针菇的生长。当昼夜温差大，可刺激菇金针菇子实体原基开始形成[5]。因此通常在早春、秋冬时期栽培。
1.2.4 湿度
金针菇生长对湿度的要求较高。在菌丝生长阶段，需要约65%70%的水分，而在子实体原基形成阶段，需要相对湿度保持在85%左右，在子实体生长阶段，需要相对湿度保持在90%左右。
1.2.5 光照
微弱的光线有助于菌盖的生长。在完全黑暗的条件下，虽然也能生长，但生长速度慢，且形成的菌盖较小，形成畸形菇的可能性大大增加；而光线过强则会抑制菌柄生长，不利于金针菇的生长。
1.2.6 pH
金针菇需要在偏酸性的环境中生长，因此菌丝的最适pH为47，而子实体形成期的最适pH为56[6]。
1．3 原生质体的制备和再生
原生质体融合技术打破了微生物的种界界限，最近几年，受到国内外学者的广泛关注，在生物领域受到极大的重视。要进行原生质体融合，首先要酶解制备大量的原生质体，并使原生质体能按需要稳定高效地再生细胞壁，才能要取得融合的成功[7]。而探索特定菌种原生质体形成和再生的条件，是原生质体技术的关键前提。与细菌、放线菌和酵母的细胞壁相比，真菌的细胞壁更复杂，即使在种类相近的真菌中，细胞壁化学成分的种类和比例也有较大差异[8]。
1.3.1 影响原生质体制备的因素
原生质体的制备率受不同的条件的影响，如年龄、酶浓度、温度、预处理等因素，对原生质体制备有不同的影响。
1.3.1.1菌龄对原生质体制备的影响
菌龄是影响原生质体制备的主要因素之一。在生长初期，菌丝不成熟，因此原生质体数量高；随着菌龄的增加，菌丝趋于成熟，原生质体释放量增加；若菌龄太大，细胞壁结构趋于稳定和老化，不利于酶解反应，原生质体产量显著降低。一般来说，对数生长早期的形成率比较高。
1.3.1.2 酶种类及配比对制备原生质体的影响
用酶法破壁制取原生质体是一种高效的制取方法，其中最关键的是酶。在原生质体制备时，对于不同的微生物，酶解所需的酶种类及配比各不相同，同时酶的纯度、质量等因素对原生质体的形成也有很大影响。由于酶的专一性，不同的酶针对不同的酶解对象。酶用量不同，酶解效果可能会相距甚远：酶的量和浓度太低时，原生质体破壁困难，所以产量不足；酶的量和浓度过高时，杂酶浓度会随之增加，原生质体不稳定，甚至会破裂，产量也会下降。金针菇属于真菌，真菌细胞壁中主要成分为纤维素、 葡聚糖、几丁质、甘露聚糖等，所以金针菇的原生质体制备时当选取具有分解几丁质、纤维素作用的酶时效果比较显著。
1.3.1.3 酶解时间对原生质体制备的影响
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