金针菇原生质体紫外诱变选育研究
本实验对金针菇原生质体悬液进行紫外诱变处理，采用刚果红平板透明圈法进行初筛，液体摇瓶培养法复筛,以出发菌株作为对照，比较突变株和出发菌株的Hc值和菌体生物量，经过反复筛选后，最终获得一株金针菇的紫外突变株GMR16。所获得的诱变菌株的菌体生物量明显高于原始菌株，在培养96 h 时，突变菌株的生物量为0.4947 g，是原始菌株的1.50倍。对突变株GMR16进行遗传稳定性实验，经5次的连续传代培养，诱变菌株GMR16的菌体干重维持在0.49 g附近，无多大变化。由此得出突变菌株GMR16的遗传稳定性能良好。关键词 金针菇，原生质体，紫外诱变，菌种选育
目 录
1 引言 1
1.1 金针菇概述 1
1.2 原生质体简介? 2
1.3 金针菇原生质体育种的研究现状? 2
1.4 选题意义 3
1.5 前景与展望 3
2 实验材料和方法 4
2.1 实验材料、试剂及仪器 4
2.2 实验方法 5
3 实验结果与分析 6
3.1 紫外诱变剂量的选择 6
3.2 突变菌株的初筛 7
3.3 突变菌株的复筛 9
3.4 诱变菌种的遗传稳定性测定 10
3.5 生长过程中诱变和对照菌株生物量的变化研究 11
结 论 13
致 谢 14
参考文献...............................................................................................................................15
1 引言
金针菇含有糖类、蛋白质和多种维生素，具有很高的药用和营养价值，同时具有增强消化、抗癌、增强机体的免疫力等作用。但目前金针菇栽培所用的母种长势较弱，培养时间相对较长。经过诱变育种筛选能够得到长势旺、生长时间短的菌种，有利于原种、栽培种的制作及大规模的栽培生产。金针菇属于大型真菌，细胞壁的主要成份是甘露聚糖和葡聚糖，因此本实验选用配比合适的蜗牛酶和溶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
菌酶的复合酶液制备原生质体，对金针菇原生质体进行紫外诱变处理，通过刚果红鉴别培养基进行初筛，液态摇瓶培养法复筛，从而筛选出性状优良的金针菇菌种。
1.1 金针菇概述
金针菇的学名为毛柄金钱菌，又称构菌、冬菇、朴菰 、冻菌、金菇、朴菇、智力菇等，英文是：Enoki Mushroom，其植物学名是：Flammulina velutiper (GMR.) Sing。因为其菌柄较细长，形似金针菜，故称为金针菇，属于伞菌亚目针金菇属，是一种菌藻地衣类食用真菌。金针菇具有很高的药用和食疗作用[12]。同时在世界各地均有分布，如：中国、澳大利亚、欧洲、俄罗斯、北美洲、日本等地。
金针菇属于一种容易生长在木材上的腐生类真菌，在榆树、柳树、白杨树等阔叶类树木的树桩上和枯树干易繁殖生长[3]。金针菇中没有叶绿素，同时不能够进行光合作用，也不能够制造出葡萄糖等碳水化合物，可以在没有光线的环境之中生长，所以必须从培养环境之中吸收各种有机物质，如蛋白质、脂肪的降解物和碳水化合物等，属于一种异养型生物。
金针菇是由两大部分组成分别为：繁殖器官(子实体)，营养器官(菌丝体)。（1）营养器官是由孢子萌发生成，在通常情况下，菌丝通常是呈白色的绒毛状，并且具有分枝和横隔。金针菇的菌丝体和其它食用菌的最大的不同之处是：金针菇的菌丝生长一段时间后能够形成大量的分生孢子，这些分生孢子在适宜的培养条件下可以萌发成双核菌丝或单核菌丝。有些实验表明，金针菇菌株质量的优劣与金针菇在菌丝阶段时粉孢子数量的多少有关，分生孢子数量较少的菌株，其菌株质量都好一些，并且菌柄基部的颜色比较浅。（2）繁殖器官的主要功能为产生孢子。金针菇的子实体由三部分组成，分别为：菌盖、菌柄、菌褶，同时大多数子实体是成束生长。菌柄的表面生长着密集的黑褐色绒毛，呈圆柱状且中空，略微有一些弯曲，直径约为0.3~1.5厘米，长约为3.5~15厘米。同时菌柄基部呈紧密相连，下部呈革质，上部为肉质（也有的资料介绍说菌柄为胶质、纤维质），菌褶的子实层上能够生长出担孢子，孢子为圆柱状。菌盖的表面呈扁半球形或呈球形，幼时为球形，生长过程中逐渐平展，当成熟后边缘开始皱折的同时向上翻卷。菌盖的颜色呈黄白或黄褐，表面具有一层胶质薄层，菌褶为象牙色或白色，菌肉为白色，边缘薄，中央厚。
1.2 原生质体简介
原生质体指利用人为的手段去除细胞壁后的细胞。它主要是由三部分组成，分别为：细胞器、质膜、胞基质。去除细胞壁方法主要是非酶分离法、机械法和酶解法，在实际应用中大多采用酶解法，因为酶解法具有一些其他两类方法没有的优点，如效果好、所用时间短、操作简单同时对细胞没有较大的损伤等优点。本实验中使用的菌种是金针菇，其细胞壁的主要成分为纤维素、几丁质、甘露聚糖和葡聚糖等，因此选用溶菌酶和蜗牛酶配制而成的复合酶制备金针菇的原生质体。溶菌酶相较于其他酶而言，破碎细胞壁效果更好。蜗牛酶是一种由蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等组合而成的复合酶，主要应用与破碎真菌或植物的细胞壁。因此采用这两种酶配制而成的复合酶能够更好地制备出金针菇原生质体。
1.3 金针菇原生质体育种的研究现状
原生质体育种是21世纪发展起来的一项新的生物工程育种技术，科研人员在1972年的时候就开始对高等担子菌的原生质体进行研究，到目前为止，已经对超过60种食用菌的原生质体育种技术进行报道，其中蘑菇、金针菇、平菇、香菇等一些人工栽培面积较大的菌种，其原生质体育种技术已经日渐成熟[4]。当前通过原生质体育种技术得到的新型菌种，其遗传稳定性尚且存在着较大的问题[5]。诸多的研究表明，原生质体融合过程中存在着一些融合频率较低的核融合菌株。由于原生质体的单核型融合菌株的遗传稳定性比较大，因此通常选用合适的筛选标记得到单核核型融合菌株。彭卫红等将白色的金针白雪的原生质体与黄色的金针12的次级菌丝中提取出的细胞核在高pH、高钙的条件下进行融合实验，实验结果表明：具有锁状联合结构的双核菌丝能够形成子实体，无锁状联合结构的单核菌丝则不能够形成子实体。彭卫红等还利用金针菇原生质体的不对称融合法，分别以白色的糙皮侧耳和黄色的金针12为亲本，从而筛选得到“金白1号”和“金白2号”两株特殊的金针菇菌种(子实体为白色)。金白1号在外观、口感、菌丝长势、抗杂菌能力和转潮等方面明显的优于目前主要栽种所用的菌种白雪[6]。
目 录
1 引言 1
1.1 金针菇概述 1
1.2 原生质体简介? 2
1.3 金针菇原生质体育种的研究现状? 2
1.4 选题意义 3
1.5 前景与展望 3
2 实验材料和方法 4
2.1 实验材料、试剂及仪器 4
2.2 实验方法 5
3 实验结果与分析 6
3.1 紫外诱变剂量的选择 6
3.2 突变菌株的初筛 7
3.3 突变菌株的复筛 9
3.4 诱变菌种的遗传稳定性测定 10
3.5 生长过程中诱变和对照菌株生物量的变化研究 11
结 论 13
致 谢 14
参考文献...............................................................................................................................15
1 引言
金针菇含有糖类、蛋白质和多种维生素，具有很高的药用和营养价值，同时具有增强消化、抗癌、增强机体的免疫力等作用。但目前金针菇栽培所用的母种长势较弱，培养时间相对较长。经过诱变育种筛选能够得到长势旺、生长时间短的菌种，有利于原种、栽培种的制作及大规模的栽培生产。金针菇属于大型真菌，细胞壁的主要成份是甘露聚糖和葡聚糖，因此本实验选用配比合适的蜗牛酶和溶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
菌酶的复合酶液制备原生质体，对金针菇原生质体进行紫外诱变处理，通过刚果红鉴别培养基进行初筛，液态摇瓶培养法复筛，从而筛选出性状优良的金针菇菌种。
1.1 金针菇概述
金针菇的学名为毛柄金钱菌，又称构菌、冬菇、朴菰 、冻菌、金菇、朴菇、智力菇等，英文是：Enoki Mushroom，其植物学名是：Flammulina velutiper (GMR.) Sing。因为其菌柄较细长，形似金针菜，故称为金针菇，属于伞菌亚目针金菇属，是一种菌藻地衣类食用真菌。金针菇具有很高的药用和食疗作用[12]。同时在世界各地均有分布，如：中国、澳大利亚、欧洲、俄罗斯、北美洲、日本等地。
金针菇属于一种容易生长在木材上的腐生类真菌，在榆树、柳树、白杨树等阔叶类树木的树桩上和枯树干易繁殖生长[3]。金针菇中没有叶绿素，同时不能够进行光合作用，也不能够制造出葡萄糖等碳水化合物，可以在没有光线的环境之中生长，所以必须从培养环境之中吸收各种有机物质，如蛋白质、脂肪的降解物和碳水化合物等，属于一种异养型生物。
金针菇是由两大部分组成分别为：繁殖器官(子实体)，营养器官(菌丝体)。（1）营养器官是由孢子萌发生成，在通常情况下，菌丝通常是呈白色的绒毛状，并且具有分枝和横隔。金针菇的菌丝体和其它食用菌的最大的不同之处是：金针菇的菌丝生长一段时间后能够形成大量的分生孢子，这些分生孢子在适宜的培养条件下可以萌发成双核菌丝或单核菌丝。有些实验表明，金针菇菌株质量的优劣与金针菇在菌丝阶段时粉孢子数量的多少有关，分生孢子数量较少的菌株，其菌株质量都好一些，并且菌柄基部的颜色比较浅。（2）繁殖器官的主要功能为产生孢子。金针菇的子实体由三部分组成，分别为：菌盖、菌柄、菌褶，同时大多数子实体是成束生长。菌柄的表面生长着密集的黑褐色绒毛，呈圆柱状且中空，略微有一些弯曲，直径约为0.3~1.5厘米，长约为3.5~15厘米。同时菌柄基部呈紧密相连，下部呈革质，上部为肉质（也有的资料介绍说菌柄为胶质、纤维质），菌褶的子实层上能够生长出担孢子，孢子为圆柱状。菌盖的表面呈扁半球形或呈球形，幼时为球形，生长过程中逐渐平展，当成熟后边缘开始皱折的同时向上翻卷。菌盖的颜色呈黄白或黄褐，表面具有一层胶质薄层，菌褶为象牙色或白色，菌肉为白色，边缘薄，中央厚。
1.2 原生质体简介
原生质体指利用人为的手段去除细胞壁后的细胞。它主要是由三部分组成，分别为：细胞器、质膜、胞基质。去除细胞壁方法主要是非酶分离法、机械法和酶解法，在实际应用中大多采用酶解法，因为酶解法具有一些其他两类方法没有的优点，如效果好、所用时间短、操作简单同时对细胞没有较大的损伤等优点。本实验中使用的菌种是金针菇，其细胞壁的主要成分为纤维素、几丁质、甘露聚糖和葡聚糖等，因此选用溶菌酶和蜗牛酶配制而成的复合酶制备金针菇的原生质体。溶菌酶相较于其他酶而言，破碎细胞壁效果更好。蜗牛酶是一种由蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等组合而成的复合酶，主要应用与破碎真菌或植物的细胞壁。因此采用这两种酶配制而成的复合酶能够更好地制备出金针菇原生质体。
1.3 金针菇原生质体育种的研究现状
原生质体育种是21世纪发展起来的一项新的生物工程育种技术，科研人员在1972年的时候就开始对高等担子菌的原生质体进行研究，到目前为止，已经对超过60种食用菌的原生质体育种技术进行报道，其中蘑菇、金针菇、平菇、香菇等一些人工栽培面积较大的菌种，其原生质体育种技术已经日渐成熟[4]。当前通过原生质体育种技术得到的新型菌种，其遗传稳定性尚且存在着较大的问题[5]。诸多的研究表明，原生质体融合过程中存在着一些融合频率较低的核融合菌株。由于原生质体的单核型融合菌株的遗传稳定性比较大，因此通常选用合适的筛选标记得到单核核型融合菌株。彭卫红等将白色的金针白雪的原生质体与黄色的金针12的次级菌丝中提取出的细胞核在高pH、高钙的条件下进行融合实验，实验结果表明：具有锁状联合结构的双核菌丝能够形成子实体，无锁状联合结构的单核菌丝则不能够形成子实体。彭卫红等还利用金针菇原生质体的不对称融合法，分别以白色的糙皮侧耳和黄色的金针12为亲本，从而筛选得到“金白1号”和“金白2号”两株特殊的金针菇菌种(子实体为白色)。金白1号在外观、口感、菌丝长势、抗杂菌能力和转潮等方面明显的优于目前主要栽种所用的菌种白雪[6]。
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