嗜热细菌Caldicellulosiruptorbescii极耐热纤维素酶CelA的异源表达
目 录
1 引言 1
1.1 纤维素酶来源和性质 1
1.2 纤维素酶的组分和协同作用 1
1.3.1 纤维素酶的组分 1
1.3.2 纤维素酶系内协同作用 2
1.3.3 纤维素酶及其他酶协同作用 2
1.3 纤维素酶的生产应用 2
1.4 极耐热酶的研究意义 3
1.5 极耐热酶研究进展 3
1.6 本论文研究的目的 4
2 实验材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 重组菌株及天然纤维素来源 4
2.1.2 主要试剂 4
2.1.3 主要实验仪器 5
2.1.4 实验所需溶液的配制和原料处理 6
2.2 实验内容与方法 7
2.2.1 引物设计 7
2.2.2 PCR扩增 8
2.2.3 琼脂糖凝胶与目的DNA回收 9
2.2.4 目的基因TA克隆与测序 10
2.2.5 表达质粒的构建 11
2.2.6 重组表达质粒的转化和筛选 11
2.2.7 IPTG诱导产酶 11
2.2.8 菌体破碎提取粗酶 12
2.2.9 纯酶的制备 12
2.2.10 SDS-PAGE电泳检测目的酶 13
2.2.11 纤维素酶酶活测定 16
2.2.12 目的纤维素酶酶学性质的测定 17
3 实验结果及分析 19
3.1 基因克隆 19
3.2 表达酶的分析 20
3.3 葡萄糖标准曲线的绘制 21
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
.4 酶学性质分析 21
3.4.1 最适反应温度的确定 21
3.4.2 最适反应pH的确定 22
3.4.3 热稳定性的测定 23
结 论 25
致 谢 26
参 考 文 献 27
1 引言
纤维素作为可再生资源，数量在地球上占有的比例是最大的，它是通过光合作用生成。每年地球上合成的植物总量约为1x1011t，其中40%是纤维素的含量。目前，根据人类的技术发展，只能利用一小部分自然界中的纤维素，而绝大多数的纤维素则白白浪费掉。随着技术的发展，如果人们能够将纤维素分解成葡萄糖，将纤维素分解的葡萄糖作为食品发酵工业的原料，这对于人类来说是科技发展的一大进步，可以使得我们在谷物粮食的选择范围上更加宽广[1]。
1.1 纤维素酶来源和性质
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。例如细菌、真菌、动物体内等都能够产生纤维素酶。
一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，其中比较典型的菌属有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。产纤维素酶放线菌类主要有以下几种，如高温放线菌属、链霉菌属和弯曲热单孢菌等[2]。产纤维素酶细菌类主要有丝状杆菌属、生孢纤维粘菌属、芽孢杆菌属和纤维粘菌属等，及其代表菌种嗜碱纤维单胞菌、嗜酸纤维分解菌、褐色热单孢菌和热纤梭菌等[3]。产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。
纤维素酶分子普遍具有相类似的结构，由纤维素结构域（Cellulose Binding Doman, CBD），催化结构域（Catalytic Doman, CD）和连接桥（Linker）3个部分组成[4]。由于天然纤维素存在不溶性的刚性结构、结晶状和氢键，以及纤维素酶对纤维素的降解基质研究尚不清楚，使得目前纤维素酶对天然纤维素降解效率较低[5]。
1.2 纤维素酶的组分和协同作用
1.3.1 纤维素酶的组分
纤维素酶是一种复合酶，它主要由外切 ?-葡聚糖酶 （1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, CBH）、内切β-葡聚糖酶（endo-1,4-D-glucanohydrolase）和?-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase）三组分组成，三个组分发挥协同作用将纤维素降解最终水解为葡萄糖[6]，具有很高活力的木聚糖酶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
Link.htm?lemmaId=224597&ss_c=ssc.citiao.link>活力。
1.3.2 纤维素酶系内协同作用
研究证实，不同的纤维素酶之间有协同增效作用。在晶体纤维素水解的过程中做了类似的研究，证实了内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶同样发挥协同的作用[7-9]。
外切酶在不溶性纤维的表面起作用，使得纤维素的长分子链裂开，分子末端游离，从而使得纤维素更加容易水化。而内切酶则作用于由外切酶活化过的纤维素，使β-1,4-糖苷键断裂，从而产生短链的低聚糖，随后β-葡聚糖酶把短链的低聚糖如纤维二糖、三糖等水解成葡萄糖。由于这两种酶的立体空间结构不同形成了这样的协同作用，也有研究表明这些协同作用是因为内切葡聚糖酶和CBH对纤维素有强吸附作用[10]。纤维素酶系内的其他酶的协同作用也有报道[11-12]。
1.3.3 纤维素酶及其他酶协同作用
据报道：纤维素酶与其他酶的协同作用应用在家禽饲料行业中。表明碳水化合物水解酶组合可更好地提升酶的作用效果。
不同的混合酶能更有效的水解非淀粉多糖（non-starch polysaccharides, NSP），家禽的肠道黏度降低，提高养分的吸收率。细胞壁能被混合酶更加有效降解，饲料中蛋白质的消化率得到提高，同时表明了半纤维素酶是限制细胞壁降解的因子。报道也证明了纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶三者的协同作用效果十分显著，蛋白质的消化率一定程度上得到提高，干物质的消化率也有了显著提高，蛋白质与酶的相互作用达到了显著水平。由于这些酶之间的协同作用，蛋白质消化率得到提升，饲料配方也得到优化，这些结论给实际生产带来了重大意义[13]。
1.3 纤维素酶的生产应用
国外近40年开始研究纤维素酶，代表性生产纤维素的菌体有曲霉、青霉和木霉等。研究表明里氏木霉是产纤维素酶的优良菌株。纤维素酶的生产方法包括液体发酵和固体发酵2种方法。生产原料有废纸，秸秆粉，麸皮，玉米粉和无机盐等。
目的基因TA克隆连接体系如表2-7。
1 引言 1
1.1 纤维素酶来源和性质 1
1.2 纤维素酶的组分和协同作用 1
1.3.1 纤维素酶的组分 1
1.3.2 纤维素酶系内协同作用 2
1.3.3 纤维素酶及其他酶协同作用 2
1.3 纤维素酶的生产应用 2
1.4 极耐热酶的研究意义 3
1.5 极耐热酶研究进展 3
1.6 本论文研究的目的 4
2 实验材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 重组菌株及天然纤维素来源 4
2.1.2 主要试剂 4
2.1.3 主要实验仪器 5
2.1.4 实验所需溶液的配制和原料处理 6
2.2 实验内容与方法 7
2.2.1 引物设计 7
2.2.2 PCR扩增 8
2.2.3 琼脂糖凝胶与目的DNA回收 9
2.2.4 目的基因TA克隆与测序 10
2.2.5 表达质粒的构建 11
2.2.6 重组表达质粒的转化和筛选 11
2.2.7 IPTG诱导产酶 11
2.2.8 菌体破碎提取粗酶 12
2.2.9 纯酶的制备 12
2.2.10 SDS-PAGE电泳检测目的酶 13
2.2.11 纤维素酶酶活测定 16
2.2.12 目的纤维素酶酶学性质的测定 17
3 实验结果及分析 19
3.1 基因克隆 19
3.2 表达酶的分析 20
3.3 葡萄糖标准曲线的绘制 21
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
.4 酶学性质分析 21
3.4.1 最适反应温度的确定 21
3.4.2 最适反应pH的确定 22
3.4.3 热稳定性的测定 23
结 论 25
致 谢 26
参 考 文 献 27
1 引言
纤维素作为可再生资源，数量在地球上占有的比例是最大的，它是通过光合作用生成。每年地球上合成的植物总量约为1x1011t，其中40%是纤维素的含量。目前，根据人类的技术发展，只能利用一小部分自然界中的纤维素，而绝大多数的纤维素则白白浪费掉。随着技术的发展，如果人们能够将纤维素分解成葡萄糖，将纤维素分解的葡萄糖作为食品发酵工业的原料，这对于人类来说是科技发展的一大进步，可以使得我们在谷物粮食的选择范围上更加宽广[1]。
1.1 纤维素酶来源和性质
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。例如细菌、真菌、动物体内等都能够产生纤维素酶。
一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，其中比较典型的菌属有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。产纤维素酶放线菌类主要有以下几种，如高温放线菌属、链霉菌属和弯曲热单孢菌等[2]。产纤维素酶细菌类主要有丝状杆菌属、生孢纤维粘菌属、芽孢杆菌属和纤维粘菌属等，及其代表菌种嗜碱纤维单胞菌、嗜酸纤维分解菌、褐色热单孢菌和热纤梭菌等[3]。产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。
纤维素酶分子普遍具有相类似的结构，由纤维素结构域（Cellulose Binding Doman, CBD），催化结构域（Catalytic Doman, CD）和连接桥（Linker）3个部分组成[4]。由于天然纤维素存在不溶性的刚性结构、结晶状和氢键，以及纤维素酶对纤维素的降解基质研究尚不清楚，使得目前纤维素酶对天然纤维素降解效率较低[5]。
1.2 纤维素酶的组分和协同作用
1.3.1 纤维素酶的组分
纤维素酶是一种复合酶
Link.htm?lemmaId=224597&ss_c=ssc.citiao.link>活力。
1.3.2 纤维素酶系内协同作用
研究证实，不同的纤维素酶之间有协同增效作用。在晶体纤维素水解的过程中做了类似的研究，证实了内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶同样发挥协同的作用[7-9]。
外切酶在不溶性纤维的表面起作用，使得纤维素的长分子链裂开，分子末端游离，从而使得纤维素更加容易水化。而内切酶则作用于由外切酶活化过的纤维素，使β-1,4-糖苷键断裂，从而产生短链的低聚糖，随后β-葡聚糖酶把短链的低聚糖如纤维二糖、三糖等水解成葡萄糖。由于这两种酶的立体空间结构不同形成了这样的协同作用，也有研究表明这些协同作用是因为内切葡聚糖酶和CBH对纤维素有强吸附作用[10]。纤维素酶系内的其他酶的协同作用也有报道[11-12]。
1.3.3 纤维素酶及其他酶协同作用
据报道：纤维素酶与其他酶的协同作用应用在家禽饲料行业中。表明碳水化合物水解酶组合可更好地提升酶的作用效果。
不同的混合酶能更有效的水解非淀粉多糖（non-starch polysaccharides, NSP），家禽的肠道黏度降低，提高养分的吸收率。细胞壁能被混合酶更加有效降解，饲料中蛋白质的消化率得到提高，同时表明了半纤维素酶是限制细胞壁降解的因子。报道也证明了纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶三者的协同作用效果十分显著，蛋白质的消化率一定程度上得到提高，干物质的消化率也有了显著提高，蛋白质与酶的相互作用达到了显著水平。由于这些酶之间的协同作用，蛋白质消化率得到提升，饲料配方也得到优化，这些结论给实际生产带来了重大意义[13]。
1.3 纤维素酶的生产应用
国外近40年开始研究纤维素酶，代表性生产纤维素的菌体有曲霉、青霉和木霉等。研究表明里氏木霉是产纤维素酶的优良菌株。纤维素酶的生产方法包括液体发酵和固体发酵2种方法。生产原料有废纸，秸秆粉，麸皮，玉米粉和无机盐等。
目的基因TA克隆连接体系如表2-7。
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