具有抗革兰氏阴性细菌活性药用植物内生真菌的筛选(附件)
本课题探讨了具有抗革兰氏阴性细菌药用植物内生真菌的筛选，为药用植物内生真菌的抗菌活性物质的发掘，提供了理论依据和实践基础。通过采集药用植物样品，将样品进行处理并培养，分离出植物样品的内生真菌，然后利用抗大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922，绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa，乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphi CMCC (B) 50094的抑菌实验筛选出具有抗革兰氏阴性菌活性药用植物的内生真菌。本文选取药用植物水飞蓟作为研究对象，从水飞蓟植物的根、茎、叶和种子等部位分离内生真菌，共分离真菌19株，其中具有抗菌活性的内生真菌共有7株。关键词 革兰氏阴性细菌，药用植物，内生真菌，分离和筛选，水飞蓟
目 录
1 引言 1
1.1植物内生真菌简介 1
1.2植物内生菌的生物学作用 1
1.3 植物内生真菌发展现状及应用研究 2
1.4 植物内生真菌的开发与应用 3
1.5 内生真菌研究中存在的问题 3
1.6 药用植物水飞蓟 4
2 实验材料、试剂及仪器 5
2.1 实验材料 5
2.2 实验试剂及仪器 5
3 实验方法 6
3.1 实验流程图 6
3.2 培养基的配制 7
3.3 内生菌的筛选 8
3.4 发酵实验 9
3.5 提取实验 9
3.6 抑菌实验 10
4 结果与讨论 11
4.1 实验结果 11
4.2 讨论 19
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
1 引言
随着现代化进程的快速发展，全球性范围的环境污染也开始随之加剧，人类的健康由各种疾病威胁着，而这些疾病是由致病细菌、真菌引起的。为了减少化学合成药物的毒副作用与一些细菌带来的危害，人们开始热衷于从微生物或药用植物中研究制作天然的药物[1]。
革兰氏阴性菌通常是指革兰染色中的红色细菌。革兰阴性菌细胞壁中的肽聚糖含量低,含量比较高的是脂肪。革兰氏阴性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
菌的致病原因通常与细菌细胞壁的组成成分有关,特别是脂多糖,也被称为内毒素(LPS)。在人体中，LPS可以激发固有免疫反应应答（先天免疫应答），主要是因为它可以产生细胞因子，也可以激活免疫系统。比如说，发红是由细胞因子的产生和释放引起的。由于革兰氏阴性菌的细胞壁结构的特殊性,大多数抗生素不能有效地抑制该类细菌。
近年来，研究表明，植物内生真菌可以产生具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、杀虫等活性物质。因此,内生菌可以作为寻找新的抗菌和抗肿瘤药物的重要资源[1]。
1.1植物内生真菌简介
内生真菌存在于健康的植物组织和器官中,它不会引起植物病害，并且能在宿主植物的寄生物或入侵中发挥作用[2]。因此，它可增强宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力[3]。
在植物微生态系统中,内生真菌可以与宿主建立长期和谐的关系,它们具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫和促进植物生长的生物活性。内生真菌也含有丰富的次生代谢产物，它是筛选生物活性化合物的有效方法之一。在工业发酵、农业生产、生物制药等方面具有潜在的应用价值[4]。药用植物内生真菌物种多样性十分丰富，它在药用植物资源保护与资源再生方面上具有巨大的潜力,可以做进一步系统性的研究[5]。
1.2植物内生菌的生物学作用
内生真菌生活的环境很特别，它们长期生活在植物的特殊环境中,与寄主相互作用，共同进化。一方面,植物为内生菌的生长提供了它们必要的能量和营养。从另一方面来说,内生菌也可以对植物体产生影响，它们可以通过自身产生的代谢产物或者借助信号传导发挥作用。
1.2.1 植物内生菌的固氮作用
随着人们对内生细菌的深入研究,研究人员发现,甘蔗的根、茎、叶中含有一种新的内生固氮菌——醋酸杆菌[6,7],而且含量很高，这种内生细菌有很强的抗酸能力,它能在糖浓度高的环境中生长的同时保持高效的固氮活性，还能与甘蔗建立联合固氮作用,只与甘蔗联合，表现出它严格的寄主专一性。除此之外,研究人员在水稻、玉米和等植物中也相继分离到一些内生菌，这些内生菌也具有固氮作用[8]。
1.2.2 植物内生菌促植物生长作用
内生菌能产生植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等,这些物质能直接促进植物的生长。张集慧等人[9]从兰科药用植物中分离出5种内生真菌,从真菌发酵液和菌丝体中提取5种植物激素,如赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米醇溶蛋白和玉米核苷,对兰花的生长发育有良好的影响[10]。
1.3 植物内生真菌发展现状及应用研究
一直以来，药用植物内生真菌的研究都是植物生物学领域的研究热点[6]。通过研究与药用植物的共生关系可对某些药物的形成具有重要作用。通过研究表明，几乎所有研究过的植物都含有内生真菌[11]，根据内生真菌与寄主之间的特异性分析，自然界至少有1000000种内生真菌。目前，已研究的内生真菌中至少有145种[12]。以近10年来国内外栽培的内生真菌为研究对象,研究者谭晓明等国内外学者对内生真菌的种类进行了综述。从83科212种药用植物中分离出376种内生真菌和内生真菌。物种丰富度,包括担子菌、囊和非孢子群。内生真菌的种类与数量在不同种的宿主内是不同的，而同一宿主在不同地区、不同季节及不同器官中等也是各不相同的[1]。最近几年内,不断有报道指出从各种内生真菌中发现新的抗生素。如南方红豆衫、药用植物三尖衫以及些许亚热带植物中的一些内生真菌能产生活性物质，这些活性物质能抑制和杀灭一种或多种植物病原真菌[13]。
然而，目前关于药用植物内生真菌抗菌作用的系统研究还很少,本论文主要从药用植物水飞蓟中分离内生真菌,并进行内生真菌的提取和抗革兰氏阴性细菌活性的筛选,以获取具有优良抗菌活性特点的内生真菌,为研究微生物活性成分和开发新的抗生素的奠定物质基础[3]。
1.4 植物内生真菌的开发与应用
内生真菌分布在寄主植物组织中,相对于暴露于外界环境的附生微生物和腐生微生物，植物内生菌具有更稳定更安全的生存环境,这样内生菌能更容易发挥它们的作用。同时,植物内生菌还具有一定的宿主专一性,它对宿主植物本身及其它植物几乎没有影响,而且内生菌可以通过人工接种被导入不同的植物然后通过植物种子遗传,所有内生菌具有优良的生物农药特性[4]。
目 录
1 引言 1
1.1植物内生真菌简介 1
1.2植物内生菌的生物学作用 1
1.3 植物内生真菌发展现状及应用研究 2
1.4 植物内生真菌的开发与应用 3
1.5 内生真菌研究中存在的问题 3
1.6 药用植物水飞蓟 4
2 实验材料、试剂及仪器 5
2.1 实验材料 5
2.2 实验试剂及仪器 5
3 实验方法 6
3.1 实验流程图 6
3.2 培养基的配制 7
3.3 内生菌的筛选 8
3.4 发酵实验 9
3.5 提取实验 9
3.6 抑菌实验 10
4 结果与讨论 11
4.1 实验结果 11
4.2 讨论 19
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
1 引言
随着现代化进程的快速发展，全球性范围的环境污染也开始随之加剧，人类的健康由各种疾病威胁着，而这些疾病是由致病细菌、真菌引起的。为了减少化学合成药物的毒副作用与一些细菌带来的危害，人们开始热衷于从微生物或药用植物中研究制作天然的药物[1]。
革兰氏阴性菌通常是指革兰染色中的红色细菌。革兰阴性菌细胞壁中的肽聚糖含量低,含量比较高的是脂肪。革兰氏阴性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
菌的致病原因通常与细菌细胞壁的组成成分有关,特别是脂多糖,也被称为内毒素(LPS)。在人体中，LPS可以激发固有免疫反应应答（先天免疫应答），主要是因为它可以产生细胞因子，也可以激活免疫系统。比如说，发红是由细胞因子的产生和释放引起的。由于革兰氏阴性菌的细胞壁结构的特殊性,大多数抗生素不能有效地抑制该类细菌。
近年来，研究表明，植物内生真菌可以产生具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、杀虫等活性物质。因此,内生菌可以作为寻找新的抗菌和抗肿瘤药物的重要资源[1]。
1.1植物内生真菌简介
内生真菌存在于健康的植物组织和器官中,它不会引起植物病害，并且能在宿主植物的寄生物或入侵中发挥作用[2]。因此，它可增强宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力[3]。
在植物微生态系统中,内生真菌可以与宿主建立长期和谐的关系,它们具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫和促进植物生长的生物活性。内生真菌也含有丰富的次生代谢产物，它是筛选生物活性化合物的有效方法之一。在工业发酵、农业生产、生物制药等方面具有潜在的应用价值[4]。药用植物内生真菌物种多样性十分丰富，它在药用植物资源保护与资源再生方面上具有巨大的潜力,可以做进一步系统性的研究[5]。
1.2植物内生菌的生物学作用
内生真菌生活的环境很特别，它们长期生活在植物的特殊环境中,与寄主相互作用，共同进化。一方面,植物为内生菌的生长提供了它们必要的能量和营养。从另一方面来说,内生菌也可以对植物体产生影响，它们可以通过自身产生的代谢产物或者借助信号传导发挥作用。
1.2.1 植物内生菌的固氮作用
随着人们对内生细菌的深入研究,研究人员发现,甘蔗的根、茎、叶中含有一种新的内生固氮菌——醋酸杆菌[6,7],而且含量很高，这种内生细菌有很强的抗酸能力,它能在糖浓度高的环境中生长的同时保持高效的固氮活性，还能与甘蔗建立联合固氮作用,只与甘蔗联合，表现出它严格的寄主专一性。除此之外,研究人员在水稻、玉米和等植物中也相继分离到一些内生菌，这些内生菌也具有固氮作用[8]。
1.2.2 植物内生菌促植物生长作用
内生菌能产生植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等,这些物质能直接促进植物的生长。张集慧等人[9]从兰科药用植物中分离出5种内生真菌,从真菌发酵液和菌丝体中提取5种植物激素,如赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米醇溶蛋白和玉米核苷,对兰花的生长发育有良好的影响[10]。
1.3 植物内生真菌发展现状及应用研究
一直以来，药用植物内生真菌的研究都是植物生物学领域的研究热点[6]。通过研究与药用植物的共生关系可对某些药物的形成具有重要作用。通过研究表明，几乎所有研究过的植物都含有内生真菌[11]，根据内生真菌与寄主之间的特异性分析，自然界至少有1000000种内生真菌。目前，已研究的内生真菌中至少有145种[12]。以近10年来国内外栽培的内生真菌为研究对象,研究者谭晓明等国内外学者对内生真菌的种类进行了综述。从83科212种药用植物中分离出376种内生真菌和内生真菌。物种丰富度,包括担子菌、囊和非孢子群。内生真菌的种类与数量在不同种的宿主内是不同的，而同一宿主在不同地区、不同季节及不同器官中等也是各不相同的[1]。最近几年内,不断有报道指出从各种内生真菌中发现新的抗生素。如南方红豆衫、药用植物三尖衫以及些许亚热带植物中的一些内生真菌能产生活性物质，这些活性物质能抑制和杀灭一种或多种植物病原真菌[13]。
然而，目前关于药用植物内生真菌抗菌作用的系统研究还很少,本论文主要从药用植物水飞蓟中分离内生真菌,并进行内生真菌的提取和抗革兰氏阴性细菌活性的筛选,以获取具有优良抗菌活性特点的内生真菌,为研究微生物活性成分和开发新的抗生素的奠定物质基础[3]。
1.4 植物内生真菌的开发与应用
内生真菌分布在寄主植物组织中,相对于暴露于外界环境的附生微生物和腐生微生物，植物内生菌具有更稳定更安全的生存环境,这样内生菌能更容易发挥它们的作用。同时,植物内生菌还具有一定的宿主专一性,它对宿主植物本身及其它植物几乎没有影响,而且内生菌可以通过人工接种被导入不同的植物然后通过植物种子遗传,所有内生菌具有优良的生物农药特性[4]。
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