蚂蟥冬眠过程中消化道细胞凋亡和能量代谢的研究
摘要：采用Caspase酶活检测法和ANNEXIN_V-PI双染法，检测蚂蟥冬眠过程中消化道细胞凋亡情况；采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶和己糖激酶法，检测其冬眠过程中能量代谢变化。结论表明，蚂蟥冬眠过程中消化道细胞冬眠初期凋亡率最高、深冬眠期凋亡率趋于稳定，深度冬眠的凋亡率约为正常温度下时期的5倍；随着冬眠时间的延长，其能量代谢逐渐减弱，到最后趋于稳定，正常时期的能量代谢速率约为冬眠时期的5~6倍。 结论：冬眠过程中蚂蟥消化道细胞的凋亡率高于正常温度，能量代谢速率低于正常温度。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1实验样品的制备3
1.2.2样品的Caspase酶活性测定3
1.2.3样品ANNEXIN_VPI双染法的显微镜观察分析3
1.2.4 样品的能量代谢检测3
2 结果与分析3
2.1蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性3
2.2蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的ANNEXIN_VPI双染法检测4
2.3 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的能量代谢检测4
3讨论5
3.1蚂蟥冬眠过程中凋亡和能量代谢应用价值的分析5
3.2 小结与展望 6
致谢6
参考文献7
图1蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性3
图2深度冬眠时期蚂蟥消化道细胞染色4
图3正常温度下蚂蟥消化道细胞染色4
图4蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的6磷酸葡萄糖脱氢酶活性4
图5蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的丙酮酸激酶活性5
图6蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的己糖激酶活性5
蚂蟥冬眠过程中消化道细胞凋亡和能量代谢的研究
学生 王闻翰
引言
蚂蟥（Whitmania Pigra Whitman）是2015年版《中华人民共和国药典》[1]中收录的药材水
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
蛭三种基原之一，又被称作宽体金线蛭，隶属于蛭纲（Hirudinea）无吻蛭目黄蛭科[2]（Haemo pidae）。临床研究表明，水蛭对心脑血管疾病具有很好的治疗作用，对肾病综合征、妇科疾病中的乳腺增生等也有很好的治疗作用[34]。
近年来虽然蚂蟥人工养殖规模越来越大，但蚂蟥冬眠习性却成为影响蚂蟥人工养殖经济效益的主要原因，目前鲜对蚂蟥冬眠机理方面的研究报道。糖代谢是能量来源的一个重要途径，6磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶与己糖激酶是糖代谢中的重要酶类，研究其酶活性对研究细胞的能量代谢具有重要意义。本次实验拟通过对蚂蟥冬眠过程中细胞凋亡和6磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶与己糖激酶的研究，为蚂蟥冬眠机理的研究及蚂蟥越冬管理提供一定的理论依据和科学指导。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
蚂蟥由本实验室提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）。
FA1104分析天平、Alpha1506紫外可见分光光度计、HHS型水浴锅、高速离心机、荧光电子显微镜、Caspase 试剂盒（南京建成生物工程研究所）、ANNEXIN_VPI试剂盒（南京建成生物工程研究所）、能量代谢酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）
1．2 方法
1．2．1 实验样品的制备
分别选取正常期（25℃时）、冬眠初期（4℃ 10 d）、深冬眠期（4℃ 50 d）若干，取其消化道，剪成12mm3小颗粒，加30倍量0.25%胰蛋白酶溶液， 37℃水浴10 min， 200目滤网过滤，移至离心管中，离心10min（1000r/min）,置入20℃环境保存待用，作为Caspase 酶活性测定和ANNEXIN_VPI双染法的样品；
分别选取25℃、10℃、8℃、6℃、4℃（入眠组）、4℃ 10d（初冬眠组）、4℃ 50d（深度冬眠组）的蚂蟥若干，按相同上述操作，作为能量代谢检测的样品。
1．2．2 Caspase酶活性测定
采用Caspase试剂盒完成Caspase3,8生理酶活性检测[5]。
1．2．3 ANNEXIN_VPI双染法检测
采用ANNEXIN_VPI双染法试剂盒、电子荧光显微显微镜完成凋亡细胞分析[6]：
A. 加入500μl结合液轻轻重悬细胞
B. 加入5μl Annexin VFIFC，轻轻混匀；再加入5μl PI，轻轻混匀。
C. 20℃用铝箔进行避光孵育10 min，上机检测。
1．2．4 样品的能量代谢检测
采用G6PDH、PK 和 HK试剂盒测出样品中的6磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶、己糖激酶活性。
1.3 数据分析
试验所得数据先用Microsoft Excel作初步处理，然后采用SPSS 20.0软件包（OneWay ANOVE，LSD）进行分析，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析
2．1 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性测定
图1 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性
注：差异的显著性已近在图中用字母线标出，相同的字母代表组间差异不显著（P>0.05），不同的字母代表组间差异显著（P<0.05）。
由图1中的测定结果可以看出，正常期蚂蟥消化道Caspase8酶活性显著高于Caspase3酶活性（P<0.05），从正常期进入冬眠初期时两者的酶活性均显著增加（P<0.05），但Caspase3酶活性的增速更快，在冬眠初期Caspase3酶活性略高于Caspase8酶活性，冬眠初期和深度冬眠期Caspase3、 Caspase8酶活性均减少并趋于相等，但仍显著大于正常期的活性（P<0.05）。
2．2 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的ANNEXIN_VPI双染法检测
图2 深度冬眠时期蚂蟥消化道细胞染色 图3 正常温度下蚂蟥消化道细胞染色
由图2、3的观察结果可以看出，进入冬眠后的蚂蟥消化道细胞凋亡率显著高于正常温度下蚂蟥消化道细胞凋亡率（P<0.05），经过抽样观测，约为正常温度下蚂蟥细胞凋亡率的5倍，且其中凋亡晚期的细胞占绝大多数。
2．3 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的能量代谢检测
图4蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的6磷酸葡萄糖脱氢酶活性
注：图中字母线表示差异的显著性，相同的字母代表组间差异不显著（P>0.05），不同的字母代表组间差异显著（P<0.05）。
由图四可以看出，25℃组蚂蟥消化道细胞的6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）活性与10℃、8℃、入眠组、冬眠组均差异显著(P<0.05)，呈现出依次降低的趋势，但初冬眠组与深度冬眠组差异不显著（P>0.05），25℃蚂蟥的6磷酸葡萄糖脱氢酶活性约为冬眠组的5倍。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1实验样品的制备3
1.2.2样品的Caspase酶活性测定3
1.2.3样品ANNEXIN_VPI双染法的显微镜观察分析3
1.2.4 样品的能量代谢检测3
2 结果与分析3
2.1蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性3
2.2蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的ANNEXIN_VPI双染法检测4
2.3 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的能量代谢检测4
3讨论5
3.1蚂蟥冬眠过程中凋亡和能量代谢应用价值的分析5
3.2 小结与展望 6
致谢6
参考文献7
图1蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性3
图2深度冬眠时期蚂蟥消化道细胞染色4
图3正常温度下蚂蟥消化道细胞染色4
图4蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的6磷酸葡萄糖脱氢酶活性4
图5蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的丙酮酸激酶活性5
图6蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的己糖激酶活性5
蚂蟥冬眠过程中消化道细胞凋亡和能量代谢的研究
学生 王闻翰
引言
蚂蟥（Whitmania Pigra Whitman）是2015年版《中华人民共和国药典》[1]中收录的药材水
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
蛭三种基原之一，又被称作宽体金线蛭，隶属于蛭纲（Hirudinea）无吻蛭目黄蛭科[2]（Haemo pidae）。临床研究表明，水蛭对心脑血管疾病具有很好的治疗作用，对肾病综合征、妇科疾病中的乳腺增生等也有很好的治疗作用[34]。
近年来虽然蚂蟥人工养殖规模越来越大，但蚂蟥冬眠习性却成为影响蚂蟥人工养殖经济效益的主要原因，目前鲜对蚂蟥冬眠机理方面的研究报道。糖代谢是能量来源的一个重要途径，6磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶与己糖激酶是糖代谢中的重要酶类，研究其酶活性对研究细胞的能量代谢具有重要意义。本次实验拟通过对蚂蟥冬眠过程中细胞凋亡和6磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶与己糖激酶的研究，为蚂蟥冬眠机理的研究及蚂蟥越冬管理提供一定的理论依据和科学指导。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
蚂蟥由本实验室提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）。
FA1104分析天平、Alpha1506紫外可见分光光度计、HHS型水浴锅、高速离心机、荧光电子显微镜、Caspase 试剂盒（南京建成生物工程研究所）、ANNEXIN_VPI试剂盒（南京建成生物工程研究所）、能量代谢酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）
1．2 方法
1．2．1 实验样品的制备
分别选取正常期（25℃时）、冬眠初期（4℃ 10 d）、深冬眠期（4℃ 50 d）若干，取其消化道，剪成12mm3小颗粒，加30倍量0.25%胰蛋白酶溶液， 37℃水浴10 min， 200目滤网过滤，移至离心管中，离心10min（1000r/min）,置入20℃环境保存待用，作为Caspase 酶活性测定和ANNEXIN_VPI双染法的样品；
分别选取25℃、10℃、8℃、6℃、4℃（入眠组）、4℃ 10d（初冬眠组）、4℃ 50d（深度冬眠组）的蚂蟥若干，按相同上述操作，作为能量代谢检测的样品。
1．2．2 Caspase酶活性测定
采用Caspase试剂盒完成Caspase3,8生理酶活性检测[5]。
1．2．3 ANNEXIN_VPI双染法检测
采用ANNEXIN_VPI双染法试剂盒、电子荧光显微显微镜完成凋亡细胞分析[6]：
A. 加入500μl结合液轻轻重悬细胞
B. 加入5μl Annexin VFIFC，轻轻混匀；再加入5μl PI，轻轻混匀。
C. 20℃用铝箔进行避光孵育10 min，上机检测。
1．2．4 样品的能量代谢检测
采用G6PDH、PK 和 HK试剂盒测出样品中的6磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶、己糖激酶活性。
1.3 数据分析
试验所得数据先用Microsoft Excel作初步处理，然后采用SPSS 20.0软件包（OneWay ANOVE，LSD）进行分析，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析
2．1 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性测定
图1 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的Caspase酶活性
注：差异的显著性已近在图中用字母线标出，相同的字母代表组间差异不显著（P>0.05），不同的字母代表组间差异显著（P<0.05）。
由图1中的测定结果可以看出，正常期蚂蟥消化道Caspase8酶活性显著高于Caspase3酶活性（P<0.05），从正常期进入冬眠初期时两者的酶活性均显著增加（P<0.05），但Caspase3酶活性的增速更快，在冬眠初期Caspase3酶活性略高于Caspase8酶活性，冬眠初期和深度冬眠期Caspase3、 Caspase8酶活性均减少并趋于相等，但仍显著大于正常期的活性（P<0.05）。
2．2 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的ANNEXIN_VPI双染法检测
图2 深度冬眠时期蚂蟥消化道细胞染色 图3 正常温度下蚂蟥消化道细胞染色
由图2、3的观察结果可以看出，进入冬眠后的蚂蟥消化道细胞凋亡率显著高于正常温度下蚂蟥消化道细胞凋亡率（P<0.05），经过抽样观测，约为正常温度下蚂蟥细胞凋亡率的5倍，且其中凋亡晚期的细胞占绝大多数。
2．3 蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的能量代谢检测
图4蚂蟥冬眠过程中消化道细胞的6磷酸葡萄糖脱氢酶活性
注：图中字母线表示差异的显著性，相同的字母代表组间差异不显著（P>0.05），不同的字母代表组间差异显著（P<0.05）。
由图四可以看出，25℃组蚂蟥消化道细胞的6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）活性与10℃、8℃、入眠组、冬眠组均差异显著(P<0.05)，呈现出依次降低的趋势，但初冬眠组与深度冬眠组差异不显著（P>0.05），25℃蚂蟥的6磷酸葡萄糖脱氢酶活性约为冬眠组的5倍。
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