its序列石斛材料的dna条形码鉴定(附件)
摘 要基于ITS序列对中药石斛DNA条形码进行鉴定研究，方法选取11个石斛样品提取DNA, PCR程序扩增、双向测序获得ITS序列和GENBANK网下载序列共81条ITS序列进行鉴定分析。用MEGA 6.0软件来计算种内、种间遗传距离，构建邻接树，在中药材DNA条形码鉴定系统中对样品提取获得的ITS序列进行分析鉴定。目的利用ITS条形码标记技术对石斛药材进行鉴定分组。实验结果显示这11个石斛材料的ITS序列能很好地对应并聚类在该材料本身所在的石斛组的分支上，而且具备中度到高度的支持率。其中种间遗传距离大于种内遗传距离说明此次实验选择提取DNA ITS序列，能够很好的将石斛属物种进行鉴定。结论显示ITS序列可以很好的作为石斛属药用植物的DNA分子条形码鉴定。
目 录
1 绪论 1
1.1 研究背景与立题依据 1
1.2 石斛属中药材种类现状 2
1.2.1 石斛品种名贵，种类繁多 2
1.2.2 石斛外观形态相似，传统鉴别方法较难鉴定 2
1.3 研究现状 2
1.3.1 DNA条形码鉴定原理 2
1.3.2 DNA ITS序列分析与鉴定 3
2 研究内容 5
2.1 研究目的 5
2.2 实验内容 5
2.2.1 实验材料的编号与登记 5
2.2.2 实验试剂、器材 6
2.2.3 样品石斛 DNA分子的提取 6
2.2.4 石斛提取DNA序列ITS扩增、测序 7
2.2.5 琼脂糖凝胶电泳法检测产物 8
2.3 数据处理与分析鉴定 8
3 结果与分析讨论 11
3.1 石斛ITS序列种内种间变异结果分析 11
3.2 分析结果讨论 15
结 论 17
参考文献 19
致谢 21
1 绪论
1.1 研究背景与立题依据
石斛属是兰科植物中最大的植物属之一，其为多年生的草本科植物。许多石斛种如铁皮石斛（Dendrobium?officinale）,金钗石斛（Dendrobium nobi *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
le）、鼓槌石斛（Dendrobium?chrysotoxum）等是著名的中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效[1]，与人参、灵芝、冬虫夏草等被列为上品中药。石斛属植物主要含生物碱、多糖、甾体以及挥发油等许多化学成分。临床上有调节血糖、提高免疫力、防御肿瘤等作用，而且在治疗胃肠方面疾病也有非常好的疗效。[15]
目前石斛原生种约有1500种，我国主要分布在云南、四川、重庆等地区，有近80种，其中33种作为药用。同一个石斛种的生长易受到环境因素影响，不同的繁殖培育条件下，形态特征以及所含有的化学组成成分差别较大，外观形态具有较大的相似性。另外石斛药材来源大多来自于野生资源，资源短缺之外还存在药用石斛种类混乱等现象，除去兰科中石斛属有50余种植物，还有将近20种兰科植物也混入其中。这个情况的存在对石斛临床使用以及用药安全造成特别严重的危害。因此石斛的分组鉴定、真伪鉴别的研究对于保证临床用药安全、有效起至关重要的意义。然而石斛变种数量较多，鲜品入药鉴别难度加大，利用传统的外观形态鉴别、显微组织鉴别、化学成分分析方法在石斛的亲缘鉴定以及分组上具有很大的难度，因此石斛被评为“医工难辨”的一类中药材。
由于传统的鉴定方法在石斛中药材物种鉴定分析上有着一定难度以及操作局限性，所以现研究发现在传统鉴定方法的基础上增加中药材DNA条形码分子鉴定。以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材是中药材DNA条形码分子鉴定的方法体系，即DNA barcoding，即以一段标准DNA序列作为标记，短时间内进行准确的自动化物种鉴定，看起来特别像超市扫描每件商品上的条形码并进行区分、分组与登记。DNA条形编码之父PaulHebert首先倡导将条形码编码技术应用到生物物种鉴定中[2]。中药材的鉴定过程要求具备简单、精确的特点，然而中药材DNA条形码分子鉴定技术恰好拥有明确的判断标准，能很好的对中药材及中药基原物种进行准确的分组与鉴别。因此实验通过DNA条形码分子鉴定方法提取石斛样品的DNA ITS 序列，对其条形码序列进行低质量区剪切以及序列种内种间遗传距离的分析鉴定比对、建立亲缘关系的分组。使石斛属植物的物种得到保护，在市场中石斛药材的真伪鉴定也具有非常重要的影响。
1.2 石斛属中药材种类现状
1.2.1 石斛品种名贵，种类繁多
全球石斛属有近1000种，集中分布在亚热带地区至大洋洲。目前我国有80种和2变种，生长在秦岭至南许多省市地区，我国云南省南部为石斛种植生产主要地区。其中我国国产石斛种类中茎细且花小的类群，可作为石斛原植物入药；茎粗而花大的种类便可作花卉供人们观赏。石斛属下级分组中又有剑叶组、瘦轴组、顶叶组、石斛组、心叶组、草叶组、叉唇组等，其中石斛组具有最多的石斛种。然而石斛在非人工环境下出芽率低，对繁育环境因素需求较高。随着石斛药用价值的提升以及人们开始对珍贵药材的大量开采，导致野生石斛的种质资源遭到严重破坏，使石斛一步步走向了濒临灭绝的道路。
1.2.2 石斛外观形态相似，传统鉴别方法较难鉴定
石斛加工后的干品外形相似，如以石斛相似的植物材料加工后充当石斛药材，或者以药效低的石斛种冒充药效高的石解种，导致石斛的许多混伪品在市场上以假乱真，影响消费者选择。在生长状态下部分石斛在外观差异上表现不明显，而且利用传统形态鉴别、显微鉴别、成分分析方法对于石斛干品来说，在亲缘鉴定以及分组上加大了难度[10]。因此通过分子鉴定方法提取各石斛样品的DNA条形码，对其条形码序列进行鉴定比对，建立亲缘关系的鉴定与分组对石斛属植物的保护和市场石斛药材的真伪鉴定具有非常重要的意义[19]。
1.3 研究现状
1.3.1 DNA条形码鉴定原理
近年来，条形码鉴定技术已经成为科学研究的热点。条形码技术针对某个属、科的物种进行鉴定，其实验选材少、鉴定准确、鉴定过程更加快速[9]，实验在短时间内可进行大量样本的鉴定，并且其重复性和稳定性高。
薛华杰等曾通过ITS 序列研究羌活为外类群分析当归属，前胡属之间的关系和紫花前胡的分类和地位，结果显示，当归属与前胡属之间的亲缘关系较近，可将紫花前胡归属到当归属[5]。闫坤等曾针对 ITS 序列对地黄属种间的亲缘关系进行了研究，结果显示天目地黄与湖北地黄有较近的亲缘关系，高地黄和裂叶地黄为同一物种 [6]。薛华杰还通过对东亚当归属及其亲缘近种40个植物的 ITS 序列分析了东亚当归属的系统进化[7]。从许多科学家研究的结果可以得出通过分子水平探讨植物物种间的遗传距离、构建观察系统发育树、分析植物彼此间的分化过程等这些研究结果，可以有效且高效率的进行药用植物ITS序列的研究。
DNA 条形码是来发现物种多样性的鉴定和新物种的存在。在一个实验研究之前需选择制定一个种内、种间变异合适的DNA条形码序列, 统计创造一个完整的数据库, 而且该数据库中不仅要包含目前已鉴定的物种, 还要记录所有物种的分布和种间种内的差异[8]。在实验研究前确定一个物种的种内和种间的规定界限[28, 29], 通过对未知植物种提取得到的DNA 条形码序列与数据库中的DNA条形码数据进行比较, 当和数据库中已有的DNA条形码序列遗传距离小于遗传界限时就认为二者为同一物种,但是若与所有的物种遗传距离都大于这个界限时就认为得到的是一个新物种,称之为“Thresholdbased method”[30]。
目 录
1 绪论 1
1.1 研究背景与立题依据 1
1.2 石斛属中药材种类现状 2
1.2.1 石斛品种名贵，种类繁多 2
1.2.2 石斛外观形态相似，传统鉴别方法较难鉴定 2
1.3 研究现状 2
1.3.1 DNA条形码鉴定原理 2
1.3.2 DNA ITS序列分析与鉴定 3
2 研究内容 5
2.1 研究目的 5
2.2 实验内容 5
2.2.1 实验材料的编号与登记 5
2.2.2 实验试剂、器材 6
2.2.3 样品石斛 DNA分子的提取 6
2.2.4 石斛提取DNA序列ITS扩增、测序 7
2.2.5 琼脂糖凝胶电泳法检测产物 8
2.3 数据处理与分析鉴定 8
3 结果与分析讨论 11
3.1 石斛ITS序列种内种间变异结果分析 11
3.2 分析结果讨论 15
结 论 17
参考文献 19
致谢 21
1 绪论
1.1 研究背景与立题依据
石斛属是兰科植物中最大的植物属之一，其为多年生的草本科植物。许多石斛种如铁皮石斛（Dendrobium?officinale）,金钗石斛（Dendrobium nobi *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
le）、鼓槌石斛（Dendrobium?chrysotoxum）等是著名的中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效[1]，与人参、灵芝、冬虫夏草等被列为上品中药。石斛属植物主要含生物碱、多糖、甾体以及挥发油等许多化学成分。临床上有调节血糖、提高免疫力、防御肿瘤等作用，而且在治疗胃肠方面疾病也有非常好的疗效。[15]
目前石斛原生种约有1500种，我国主要分布在云南、四川、重庆等地区，有近80种，其中33种作为药用。同一个石斛种的生长易受到环境因素影响，不同的繁殖培育条件下，形态特征以及所含有的化学组成成分差别较大，外观形态具有较大的相似性。另外石斛药材来源大多来自于野生资源，资源短缺之外还存在药用石斛种类混乱等现象，除去兰科中石斛属有50余种植物，还有将近20种兰科植物也混入其中。这个情况的存在对石斛临床使用以及用药安全造成特别严重的危害。因此石斛的分组鉴定、真伪鉴别的研究对于保证临床用药安全、有效起至关重要的意义。然而石斛变种数量较多，鲜品入药鉴别难度加大，利用传统的外观形态鉴别、显微组织鉴别、化学成分分析方法在石斛的亲缘鉴定以及分组上具有很大的难度，因此石斛被评为“医工难辨”的一类中药材。
由于传统的鉴定方法在石斛中药材物种鉴定分析上有着一定难度以及操作局限性，所以现研究发现在传统鉴定方法的基础上增加中药材DNA条形码分子鉴定。以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材是中药材DNA条形码分子鉴定的方法体系，即DNA barcoding，即以一段标准DNA序列作为标记，短时间内进行准确的自动化物种鉴定，看起来特别像超市扫描每件商品上的条形码并进行区分、分组与登记。DNA条形编码之父PaulHebert首先倡导将条形码编码技术应用到生物物种鉴定中[2]。中药材的鉴定过程要求具备简单、精确的特点，然而中药材DNA条形码分子鉴定技术恰好拥有明确的判断标准，能很好的对中药材及中药基原物种进行准确的分组与鉴别。因此实验通过DNA条形码分子鉴定方法提取石斛样品的DNA ITS 序列，对其条形码序列进行低质量区剪切以及序列种内种间遗传距离的分析鉴定比对、建立亲缘关系的分组。使石斛属植物的物种得到保护，在市场中石斛药材的真伪鉴定也具有非常重要的影响。
1.2 石斛属中药材种类现状
1.2.1 石斛品种名贵，种类繁多
全球石斛属有近1000种，集中分布在亚热带地区至大洋洲。目前我国有80种和2变种，生长在秦岭至南许多省市地区，我国云南省南部为石斛种植生产主要地区。其中我国国产石斛种类中茎细且花小的类群，可作为石斛原植物入药；茎粗而花大的种类便可作花卉供人们观赏。石斛属下级分组中又有剑叶组、瘦轴组、顶叶组、石斛组、心叶组、草叶组、叉唇组等，其中石斛组具有最多的石斛种。然而石斛在非人工环境下出芽率低，对繁育环境因素需求较高。随着石斛药用价值的提升以及人们开始对珍贵药材的大量开采，导致野生石斛的种质资源遭到严重破坏，使石斛一步步走向了濒临灭绝的道路。
1.2.2 石斛外观形态相似，传统鉴别方法较难鉴定
石斛加工后的干品外形相似，如以石斛相似的植物材料加工后充当石斛药材，或者以药效低的石斛种冒充药效高的石解种，导致石斛的许多混伪品在市场上以假乱真，影响消费者选择。在生长状态下部分石斛在外观差异上表现不明显，而且利用传统形态鉴别、显微鉴别、成分分析方法对于石斛干品来说，在亲缘鉴定以及分组上加大了难度[10]。因此通过分子鉴定方法提取各石斛样品的DNA条形码，对其条形码序列进行鉴定比对，建立亲缘关系的鉴定与分组对石斛属植物的保护和市场石斛药材的真伪鉴定具有非常重要的意义[19]。
1.3 研究现状
1.3.1 DNA条形码鉴定原理
近年来，条形码鉴定技术已经成为科学研究的热点。条形码技术针对某个属、科的物种进行鉴定，其实验选材少、鉴定准确、鉴定过程更加快速[9]，实验在短时间内可进行大量样本的鉴定，并且其重复性和稳定性高。
薛华杰等曾通过ITS 序列研究羌活为外类群分析当归属，前胡属之间的关系和紫花前胡的分类和地位，结果显示，当归属与前胡属之间的亲缘关系较近，可将紫花前胡归属到当归属[5]。闫坤等曾针对 ITS 序列对地黄属种间的亲缘关系进行了研究，结果显示天目地黄与湖北地黄有较近的亲缘关系，高地黄和裂叶地黄为同一物种 [6]。薛华杰还通过对东亚当归属及其亲缘近种40个植物的 ITS 序列分析了东亚当归属的系统进化[7]。从许多科学家研究的结果可以得出通过分子水平探讨植物物种间的遗传距离、构建观察系统发育树、分析植物彼此间的分化过程等这些研究结果，可以有效且高效率的进行药用植物ITS序列的研究。
DNA 条形码是来发现物种多样性的鉴定和新物种的存在。在一个实验研究之前需选择制定一个种内、种间变异合适的DNA条形码序列, 统计创造一个完整的数据库, 而且该数据库中不仅要包含目前已鉴定的物种, 还要记录所有物种的分布和种间种内的差异[8]。在实验研究前确定一个物种的种内和种间的规定界限[28, 29], 通过对未知植物种提取得到的DNA 条形码序列与数据库中的DNA条形码数据进行比较, 当和数据库中已有的DNA条形码序列遗传距离小于遗传界限时就认为二者为同一物种,但是若与所有的物种遗传距离都大于这个界限时就认为得到的是一个新物种,称之为“Thresholdbased method”[30]。
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