离体ems诱发黄瓜耐冷变异体及其初步鉴定
摘要：黄瓜是喜温作物，耐冷性弱。化学诱变结合离体培养具有提高变异效率、便于筛选等特点，为黄瓜耐冷种质的创造提供了新途径。本研究确立了EMS诱变体系为1% EMS处理6h，并验证了再生培养基（MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L ABA）和生根培养基（1/2MS）对“南水1号”的再生效果，结果表明出芽率达78%，每外植体出芽数1.3，生根率为88%。在诱变体系和离体再生体系基础上，对材料进行诱变，通过冷胁迫后的表型选择，初步得到了耐冷变异植株。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.1.1 材料2
1.1.2 试剂2
1.2 EMS诱变体系的建立2
1.2.1 诱变2
1.2.2 接种2
1.2.3 统计3
1.3 子叶节再生体系的验证 3
1.3.1 无菌苗获得3
1.3.2 子叶节接种3
1.3.3 生根培养3
1.3.4 驯化移栽3
1.3.5 统计分析3
1.4 变异群体的构建及初步鉴定3
1.4.1 构建变异群体3
1.4.2 低温处理3
1.4.3 耐冷性的初步鉴定3
2 结果与分析4
2.1 适宜诱变剂量的选择4
2.2 离体再生效果的评估4
2.3 变异植株的表型鉴定5
3 讨论 6
3.1 离体化学诱变优化了变异体的获得过程6
3.2 离体化学诱变在优化变异体获得过程中的不足7
3.3 总结7
致谢7
参考文献8
离体甲基磺酸乙酯诱发黄瓜耐冷变异体及初步鉴定
引言
黄瓜( Cucumis sativus L.)原产于印度[1,2]，是一种喜温的重要经济作物。一般条件下，当温度小于10℃时会造成生理活动失调，在没有经过低温锻炼或者温度骤降至5—10℃的情
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
况下会出现冷害，2—3℃则会造成植株的死亡[3]。冬春季黄瓜保护地生产在早春和晚秋时节进行，此时期气温较低，容易引起黄瓜冷害的发生，给其生产活动带来不利影响，是冬春季黄瓜保护地生产中最主要的限制因素[4]。
通过人工诱变、有性杂交、转基因等途径培育的耐冷品种能从根本上解决这个问题，而这些途径的本质则是耐冷基因的获得或应用。其中人工诱变方法不仅具有直接育成新品种的潜力，并且还是挖掘耐冷基因的有效手段之一，故而在育种实践以及基因功能研究上都具有显著的意义和价值。根据诱变因子所属的范畴不同，人工诱变可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变。其中化学诱变具有点突变频率高、易操作等特点，尤其是当以EMS为诱变剂时，诱变最为有效且负面影响小[5]，因而成为一种应用广泛的人工诱变方式。并且随着现代生物技术的发展，人工诱变更是呈现出与分子技术密切结合的新趋势[6]，离体培养结合化学诱变就是其中的一个例子。由于这两种技术整合而涌现出的一些新优点，如突变效率的叠加，选择效率的提高，以及更少空间的占用等[7]，极大优化了变异体获得的多个环节，已在不同园艺植物[8~13]中得到应用，然而在黄瓜中尚少有相关报道。
本研究以获得耐冷性变异体为目标，以离体化学诱变技术为手段，并初步探索了该技术的两个重要组成环节——化学诱变体系和子叶节再生体系的建立和验证，从而为该技术在黄瓜中的应用打下了一个基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1.1.1 材料 供试材料为黄瓜品种‘南水1号’的种子，由大学葫芦科作物遗传与种质创新实验室提供。
1.1.2 试剂 甲基磺酸乙酯（EMS），购于Sigma公司。
1．2 EMS诱变体系的建立
1．2．1 诱变 使用0.1 mol/L、pH=7.0的磷酸缓冲液配制0、1%(v/v)、1.5%(v/v)和2%(v/v)的EMS溶液。取饱满一致的种子，用30℃温水浸种4h后，分别放入不同浓度EMS溶液里处理6h、10h和24h，共12个处理，每处理15~20粒种子。处理过程于摇床( 100r/min，25℃) 上进行。处理结束后用100mM硫代硫酸钠浸泡种子3次，每次5min，以终止反应。最后用清水冲洗干净。
1．2．2 接种 在超净工作台上将处理好的种子用75%的酒精消毒30s，之后用30%次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3~4次，平放于MS培养基上。培养温度为(25±2)℃，光照12 h/d，光强2000~2500 lx。
1．2．3 统计 接种一周后统计发芽的种子数。计算发芽率和致死率，其中发芽率=发芽种子数/种子数；致死率=（CK发芽率—处理发芽率）/ CK发芽率。
1．3 子叶节再生体系的验证
1．3．1 无菌苗获得 选取饱满一致的种子浸种后，接种于MS培养基上。
1．3．2 子叶节接种 选取子叶已经脱离种壳，但尚未展开的无菌苗，在超净工作台上切取子叶，稍带2~3mm下胚轴，并从下胚轴处纵切子叶，刮去顶芽，切去子叶的上1/4~1/3，得到子叶节。将其平放于芽诱导培养基（MS+1.5mg/L 6BA+0.2mg/L ABA）上。培养的温度和光照条件同1.2.2。
1．3．3 生根培养 待不定芽发出后，将其从外植体切下，转接到1/2 MS培养基生根。
1．3．4 驯化移栽 待幼苗生根后，在一周的时间内逐渐打开瓶盖炼苗。之后取出植株，洗净根系，移栽到基质中，在光照培养箱内培养7~10天后（为保证湿度，把苗放入覆膜的周转箱中，并每天喷水），转移到自然条件下生长。
1．3．5 统计分析 在再生的过程中，陆续对再生的外植体、不定芽、生根植株和炼苗后成活的植株进行计数，并分别计算出芽率、每外植体出芽数、生根率和炼苗成活率（以下简称成活率）。其中，出芽率=（出芽外植体数/总外植体数）×100%；每外植体出芽数=总芽数/出芽外植体数；生根率=生根芽数/总芽数；成活率=炼苗后成活株数/总株数。
1.4 变异群体的构建及初步鉴定
1．4．1 构建变异群体 选取饱满一致的种子，按照建立的诱变体系处理种子，之后依据已验证的再生体系接种子叶节，芽再生后转入生根培养基，获得不定芽变异群体。
1．4．2 低温处理 将变异群体放入光照培养箱进行低温胁迫处理（8/6℃，12h/12h，12000lx）。5d后，观察植株表型。
1．4．3 耐冷性的初步鉴定 冷害的形态鉴定参照Semeniuk[14,15] 的方法，由于变异群体遭受到了低温和EMS的双重伤害，表型上并不完全符合出现脱水斑的冷害症状，因此对鉴定方法进行了修改，主要根据黄瓜第二片真叶的受伤害症状对变异植株进行分级，其中C0 级：叶片表型正常，无明显可见的伤害症状；C1级：叶片小于20%的面积受害，或叶缘褪色；C2 级：叶片约有20%~40%的面积出现伤害症状；C3级：叶片约有40%~60%的面积出现伤害症状；C4 级：叶片约有60%~80%面积出现伤害症状；C5 级：叶片80%~100%的面积出现干枯、萎蔫或黄化等伤害症状。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.1.1 材料2
1.1.2 试剂2
1.2 EMS诱变体系的建立2
1.2.1 诱变2
1.2.2 接种2
1.2.3 统计3
1.3 子叶节再生体系的验证 3
1.3.1 无菌苗获得3
1.3.2 子叶节接种3
1.3.3 生根培养3
1.3.4 驯化移栽3
1.3.5 统计分析3
1.4 变异群体的构建及初步鉴定3
1.4.1 构建变异群体3
1.4.2 低温处理3
1.4.3 耐冷性的初步鉴定3
2 结果与分析4
2.1 适宜诱变剂量的选择4
2.2 离体再生效果的评估4
2.3 变异植株的表型鉴定5
3 讨论 6
3.1 离体化学诱变优化了变异体的获得过程6
3.2 离体化学诱变在优化变异体获得过程中的不足7
3.3 总结7
致谢7
参考文献8
离体甲基磺酸乙酯诱发黄瓜耐冷变异体及初步鉴定
引言
黄瓜( Cucumis sativus L.)原产于印度[1,2]，是一种喜温的重要经济作物。一般条件下，当温度小于10℃时会造成生理活动失调，在没有经过低温锻炼或者温度骤降至5—10℃的情
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
况下会出现冷害，2—3℃则会造成植株的死亡[3]。冬春季黄瓜保护地生产在早春和晚秋时节进行，此时期气温较低，容易引起黄瓜冷害的发生，给其生产活动带来不利影响，是冬春季黄瓜保护地生产中最主要的限制因素[4]。
通过人工诱变、有性杂交、转基因等途径培育的耐冷品种能从根本上解决这个问题，而这些途径的本质则是耐冷基因的获得或应用。其中人工诱变方法不仅具有直接育成新品种的潜力，并且还是挖掘耐冷基因的有效手段之一，故而在育种实践以及基因功能研究上都具有显著的意义和价值。根据诱变因子所属的范畴不同，人工诱变可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变。其中化学诱变具有点突变频率高、易操作等特点，尤其是当以EMS为诱变剂时，诱变最为有效且负面影响小[5]，因而成为一种应用广泛的人工诱变方式。并且随着现代生物技术的发展，人工诱变更是呈现出与分子技术密切结合的新趋势[6]，离体培养结合化学诱变就是其中的一个例子。由于这两种技术整合而涌现出的一些新优点，如突变效率的叠加，选择效率的提高，以及更少空间的占用等[7]，极大优化了变异体获得的多个环节，已在不同园艺植物[8~13]中得到应用，然而在黄瓜中尚少有相关报道。
本研究以获得耐冷性变异体为目标，以离体化学诱变技术为手段，并初步探索了该技术的两个重要组成环节——化学诱变体系和子叶节再生体系的建立和验证，从而为该技术在黄瓜中的应用打下了一个基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1.1.1 材料 供试材料为黄瓜品种‘南水1号’的种子，由大学葫芦科作物遗传与种质创新实验室提供。
1.1.2 试剂 甲基磺酸乙酯（EMS），购于Sigma公司。
1．2 EMS诱变体系的建立
1．2．1 诱变 使用0.1 mol/L、pH=7.0的磷酸缓冲液配制0、1%(v/v)、1.5%(v/v)和2%(v/v)的EMS溶液。取饱满一致的种子，用30℃温水浸种4h后，分别放入不同浓度EMS溶液里处理6h、10h和24h，共12个处理，每处理15~20粒种子。处理过程于摇床( 100r/min，25℃) 上进行。处理结束后用100mM硫代硫酸钠浸泡种子3次，每次5min，以终止反应。最后用清水冲洗干净。
1．2．2 接种 在超净工作台上将处理好的种子用75%的酒精消毒30s，之后用30%次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3~4次，平放于MS培养基上。培养温度为(25±2)℃，光照12 h/d，光强2000~2500 lx。
1．2．3 统计 接种一周后统计发芽的种子数。计算发芽率和致死率，其中发芽率=发芽种子数/种子数；致死率=（CK发芽率—处理发芽率）/ CK发芽率。
1．3 子叶节再生体系的验证
1．3．1 无菌苗获得 选取饱满一致的种子浸种后，接种于MS培养基上。
1．3．2 子叶节接种 选取子叶已经脱离种壳，但尚未展开的无菌苗，在超净工作台上切取子叶，稍带2~3mm下胚轴，并从下胚轴处纵切子叶，刮去顶芽，切去子叶的上1/4~1/3，得到子叶节。将其平放于芽诱导培养基（MS+1.5mg/L 6BA+0.2mg/L ABA）上。培养的温度和光照条件同1.2.2。
1．3．3 生根培养 待不定芽发出后，将其从外植体切下，转接到1/2 MS培养基生根。
1．3．4 驯化移栽 待幼苗生根后，在一周的时间内逐渐打开瓶盖炼苗。之后取出植株，洗净根系，移栽到基质中，在光照培养箱内培养7~10天后（为保证湿度，把苗放入覆膜的周转箱中，并每天喷水），转移到自然条件下生长。
1．3．5 统计分析 在再生的过程中，陆续对再生的外植体、不定芽、生根植株和炼苗后成活的植株进行计数，并分别计算出芽率、每外植体出芽数、生根率和炼苗成活率（以下简称成活率）。其中，出芽率=（出芽外植体数/总外植体数）×100%；每外植体出芽数=总芽数/出芽外植体数；生根率=生根芽数/总芽数；成活率=炼苗后成活株数/总株数。
1.4 变异群体的构建及初步鉴定
1．4．1 构建变异群体 选取饱满一致的种子，按照建立的诱变体系处理种子，之后依据已验证的再生体系接种子叶节，芽再生后转入生根培养基，获得不定芽变异群体。
1．4．2 低温处理 将变异群体放入光照培养箱进行低温胁迫处理（8/6℃，12h/12h，12000lx）。5d后，观察植株表型。
1．4．3 耐冷性的初步鉴定 冷害的形态鉴定参照Semeniuk[14,15] 的方法，由于变异群体遭受到了低温和EMS的双重伤害，表型上并不完全符合出现脱水斑的冷害症状，因此对鉴定方法进行了修改，主要根据黄瓜第二片真叶的受伤害症状对变异植株进行分级，其中C0 级：叶片表型正常，无明显可见的伤害症状；C1级：叶片小于20%的面积受害，或叶缘褪色；C2 级：叶片约有20%~40%的面积出现伤害症状；C3级：叶片约有40%~60%的面积出现伤害症状；C4 级：叶片约有60%~80%面积出现伤害症状；C5 级：叶片80%~100%的面积出现干枯、萎蔫或黄化等伤害症状。
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