肉源性细菌的粘附特性研究
摘要：细菌的粘附性能是引发食品交叉污染和食源性疾病的重要原因之一，探索食源性细菌的粘附特性是解除食源性细菌污染威胁的必要过程。本研究利用结晶紫染色法、软琼脂平板扩散法和有机试剂混合法对20种肉源性细菌粘附性、泳动性和疏水性进行探究。研究结果显示在细菌粘附的差异显著性方面，相同科或属的细菌小于不同科或属的细菌；在泳动能力方面，相同菌属的细菌的泳动能力大多数无显著差异；在疏水性方面也表现出了不同菌属间差异显著，相同菌属间无显著差异的特点。只有采用氯仿试剂测得的细菌疏水性能与细菌粘附性能有显著相关性，其余特性与细菌粘附性无显著相关性。细菌的粘附性受多种因素综合影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1材料 1
1.2试剂与仪器 2
1.2.1培养基与化学试剂2
1.2.2主要仪器设备2
1.3试验方法2
1.3.1菌株活化及接种2
1.3.2菌悬液制备2
1.3.3肉源性细菌粘附性能评价2
1.3.4菌体泳动能力3
1.3.5菌体表面特性3
1.3.6统计分析3
2结果与分析3
2.1肉源性细菌的粘附性能3
2.2菌体泳动能力7
2.3菌体表面的特性8
2.4相关性分析10
3讨论 10
致谢12
参考文献12
肉源性细菌的粘附特性研究
引言
近些年随着人们对身体健康关注度的增加，食品科学和医学领域对细菌粘附性能的研究量大幅增长。细菌在接触表面的粘附、生长并与它分泌的细胞外基质一起形成细菌生物膜。食源性细菌生物菌膜的形成是引起相关食源性疾病的根本原因[1]。其中细菌在食品生产加工的过程中粘附于加工设备和接触表面而造成的交叉污染是食品污染的主要源头[2]。阻断或抑制细菌粘附是防治与生物材料相关感染的关键环节之一。有研究表明，细菌的种类和所粘附的材料对细菌粘附能力影响较大；同种细菌对不同的材料具有不同粘附能力；不同种细菌
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
对同种材料也有不同的粘附能力[3]。通过研究细菌的粘附性能，发现影响细菌的粘附性能的因素，进而制定抑制细菌粘附污染食品的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、植物乳杆菌、液化沙雷菌、布氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、水生拉恩氏菌、阴沟肠杆菌、肠炎沙门氏菌、恶臭假单胞（E）菌、维氏气单胞（C）菌、蜂窝哈夫尼（G）菌、杀鲑气单胞1菌、荧光假单胞、莓实假单胞菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯菌、杀鲑气单胞2菌，分离自冰鲜原料鸡肉。其中杀鲑气单胞1菌蛋白分解圈小，杀鲑气单胞2菌蛋白分解圈大。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 培养基与化学试剂
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，Trypticace Soy Broth）、大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA, Transpacific Stabilization Agreement）购于青岛高科技园海博生物技术有限公司；乳酸细菌培养基（MRS）购于北京路桥技术股份有限公司。
平底透明96孔酶标板，购于美国Fisher Scientific公司。
氯仿、乙酸乙酯、二甲苯均为分析纯，购于上海化学试剂有限公司；氯化钠、乙醇、结晶紫、无水葡萄糖等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂粉、胰蛋白胨购于北京路桥技术股份有限公司。
1.2.2 主要仪器设备
SG403A Sterile GARD生物安全柜，美国BAKER 公司；
DHGⅢ电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；
SPX250BZ型生化培养箱，上海博讯实业有限医疗设备厂；
HVE50灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；
Microfuge@22R台式离心机，美国BECKMAN公司；
TG16WS高速台式离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；
WH2 微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器有限公司；
M2多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；
Easy Spiral Pro全自动螺旋接种仪，法国Interscience公司；
Scan 1200自动影像分析菌落计数仪，法国Interscience公司；
1.3 试验方法
1.3.1 菌株活化及接种
第一次活化：将80℃冻存管中的肉源性细菌菌株在TSA平板划线活化两次，挑取单菌落接种于一定量的TSB中（弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、植物乳杆菌接种于MRS中），摇晃均匀，在30℃的生化培养箱中培养18—24小时使其菌种浓度达到108CFU/mL左右。
第二次活化：取200μL 一次活化菌液接种于一定量的TSB或MRS中，涡旋均匀，在30℃的生化培养箱中培养20—24小时，备用。
1.3.2 菌悬液制备
肉源性细菌菌株按照1.3.1方法活化，活化后的菌液经12000×g离心5 min，舍弃上清液，用0.1%的BPW生理盐水洗涤菌体沉淀，重复离心洗涤过程三次，之后用一定量的BPW生理盐水悬浮菌体沉淀，测定并调整菌悬液的OD600nm使菌液浓度约为109CFU/mL，备用。
1.3.3 肉源性细菌粘附性能评价
在无菌环境下取180μL按照1.3.1活化接种的菌液注入96孔细胞培养板中，以不接种的TSB和MRS作为空白，加盖密封，在25℃的生化培养箱中培养24小时和72小时。培养特定时间后，舍弃96孔细胞培养板微孔中的细菌菌液，用BPW生理盐水洗涤三次，在室温下干燥45 min后，每孔加入200 μL 0.25%（m/v）的结晶紫染液染色30 min[4]，舍弃染液并用BPW生理盐水洗涤孔板3次，采用200 μL 95%的乙醇洗脱粘附于微孔表面的菌体，静置30min，最后将96孔细胞培养板置于酶标仪中在570 nm下测定其吸光值[5]，每个菌株重复5次。
1.3.4 菌体的泳动能力
参照Cong（2011）[6]和Hidalgo（2011）[7]的方法，采用软琼脂平板法测定各菌株的泳动能力（swimming 和swarming），软琼脂平板配方如表11。按照1.3.2制备菌悬液，用移液枪吸取3 μL各菌株的悬浮液接种至两种平板的中心位置，为使菌液充分吸收，在室温静置20min，之后放入37℃培养箱培养（swimming培养8小时，swarming培养20小时），待到达特定培养时间后用游标卡尺测定菌株扩散圈的直径（mm）；每种平板中各菌株重复6次。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1材料 1
1.2试剂与仪器 2
1.2.1培养基与化学试剂2
1.2.2主要仪器设备2
1.3试验方法2
1.3.1菌株活化及接种2
1.3.2菌悬液制备2
1.3.3肉源性细菌粘附性能评价2
1.3.4菌体泳动能力3
1.3.5菌体表面特性3
1.3.6统计分析3
2结果与分析3
2.1肉源性细菌的粘附性能3
2.2菌体泳动能力7
2.3菌体表面的特性8
2.4相关性分析10
3讨论 10
致谢12
参考文献12
肉源性细菌的粘附特性研究
引言
近些年随着人们对身体健康关注度的增加，食品科学和医学领域对细菌粘附性能的研究量大幅增长。细菌在接触表面的粘附、生长并与它分泌的细胞外基质一起形成细菌生物膜。食源性细菌生物菌膜的形成是引起相关食源性疾病的根本原因[1]。其中细菌在食品生产加工的过程中粘附于加工设备和接触表面而造成的交叉污染是食品污染的主要源头[2]。阻断或抑制细菌粘附是防治与生物材料相关感染的关键环节之一。有研究表明，细菌的种类和所粘附的材料对细菌粘附能力影响较大；同种细菌对不同的材料具有不同粘附能力；不同种细菌
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对同种材料也有不同的粘附能力[3]。通过研究细菌的粘附性能，发现影响细菌的粘附性能的因素，进而制定抑制细菌粘附污染食品的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、植物乳杆菌、液化沙雷菌、布氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、水生拉恩氏菌、阴沟肠杆菌、肠炎沙门氏菌、恶臭假单胞（E）菌、维氏气单胞（C）菌、蜂窝哈夫尼（G）菌、杀鲑气单胞1菌、荧光假单胞、莓实假单胞菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯菌、杀鲑气单胞2菌，分离自冰鲜原料鸡肉。其中杀鲑气单胞1菌蛋白分解圈小，杀鲑气单胞2菌蛋白分解圈大。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 培养基与化学试剂
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，Trypticace Soy Broth）、大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA, Transpacific Stabilization Agreement）购于青岛高科技园海博生物技术有限公司；乳酸细菌培养基（MRS）购于北京路桥技术股份有限公司。
平底透明96孔酶标板，购于美国Fisher Scientific公司。
氯仿、乙酸乙酯、二甲苯均为分析纯，购于上海化学试剂有限公司；氯化钠、乙醇、结晶紫、无水葡萄糖等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂粉、胰蛋白胨购于北京路桥技术股份有限公司。
1.2.2 主要仪器设备
SG403A Sterile GARD生物安全柜，美国BAKER 公司；
DHGⅢ电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；
SPX250BZ型生化培养箱，上海博讯实业有限医疗设备厂；
HVE50灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；
Microfuge@22R台式离心机，美国BECKMAN公司；
TG16WS高速台式离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；
WH2 微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器有限公司；
M2多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；
Easy Spiral Pro全自动螺旋接种仪，法国Interscience公司；
Scan 1200自动影像分析菌落计数仪，法国Interscience公司；
1.3 试验方法
1.3.1 菌株活化及接种
第一次活化：将80℃冻存管中的肉源性细菌菌株在TSA平板划线活化两次，挑取单菌落接种于一定量的TSB中（弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、植物乳杆菌接种于MRS中），摇晃均匀，在30℃的生化培养箱中培养18—24小时使其菌种浓度达到108CFU/mL左右。
第二次活化：取200μL 一次活化菌液接种于一定量的TSB或MRS中，涡旋均匀，在30℃的生化培养箱中培养20—24小时，备用。
1.3.2 菌悬液制备
肉源性细菌菌株按照1.3.1方法活化，活化后的菌液经12000×g离心5 min，舍弃上清液，用0.1%的BPW生理盐水洗涤菌体沉淀，重复离心洗涤过程三次，之后用一定量的BPW生理盐水悬浮菌体沉淀，测定并调整菌悬液的OD600nm使菌液浓度约为109CFU/mL，备用。
1.3.3 肉源性细菌粘附性能评价
在无菌环境下取180μL按照1.3.1活化接种的菌液注入96孔细胞培养板中，以不接种的TSB和MRS作为空白，加盖密封，在25℃的生化培养箱中培养24小时和72小时。培养特定时间后，舍弃96孔细胞培养板微孔中的细菌菌液，用BPW生理盐水洗涤三次，在室温下干燥45 min后，每孔加入200 μL 0.25%（m/v）的结晶紫染液染色30 min[4]，舍弃染液并用BPW生理盐水洗涤孔板3次，采用200 μL 95%的乙醇洗脱粘附于微孔表面的菌体，静置30min，最后将96孔细胞培养板置于酶标仪中在570 nm下测定其吸光值[5]，每个菌株重复5次。
1.3.4 菌体的泳动能力
参照Cong（2011）[6]和Hidalgo（2011）[7]的方法，采用软琼脂平板法测定各菌株的泳动能力（swimming 和swarming），软琼脂平板配方如表11。按照1.3.2制备菌悬液，用移液枪吸取3 μL各菌株的悬浮液接种至两种平板的中心位置，为使菌液充分吸收，在室温静置20min，之后放入37℃培养箱培养（swimming培养8小时，swarming培养20小时），待到达特定培养时间后用游标卡尺测定菌株扩散圈的直径（mm）；每种平板中各菌株重复6次。
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