微生物合成四氢嘧啶类相溶性溶质的初步研究
本课题的目的是筛选能够合成四氢嘧啶类物质的高效菌种、探究其合成四氢嘧啶类相容性溶质的发酵条件。从不同盐碱土中分离到8株产四氢嘧啶类相容性溶质的中度嗜盐菌，其中Y菌株产量最高具有同时产生四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的能力。研究发现，Y菌株最适生长和合成四氢嘧啶类物质的发酵条件略有差异，其最适生长条件为35℃-40℃、pH6.0-7.0、NaCl浓度100g/L，合成四氢嘧啶类相容性溶质的最适条件为30℃，pH6.0-7.0、NaCl 浓度150 g/L。在上述最适发酵条件下四氢嘧啶的总产量可达238.3 mg/L，其中四氢嘧啶占59%，羟基四氢嘧啶比例占41%，在四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的生产上具有潜在应用潜力。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1培养基配方 2
1.2菌种分离与筛选 2
1.3菌种活化 2
1.4菌种发酵条件研究 2
1.4.1不同温度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响2
1.4.2不同pH对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响2
1.4.3不同盐浓度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响2
1.5分析方法3
1.5.1四氢嘧啶类相容性溶质的提取与HPLC测定方法3
1.5.2菌体蛋白测定方法（Lowry法）3
2结果分析3
2.1菌种的分离筛选3
2.2培养温度对菌株Y生长和相容性物质合成的影响4
2.3起始pH值对菌株Y生长和相容性物质合成的影响5
2.4盐浓度对菌株Y生长和相容性物质合成的影响 6
3 讨论7
致谢7
参考文献7
微生物合成四氢嘧啶类相容性溶质的初步研究
引言
引言
四氢嘧啶类（Ecs)物质是中度嗜盐菌应答较高渗透压而合成的相容性溶质,由于Ecs能够在高温、冷冻、干燥、射线、自由基等不利条件下保护酶、核酸、细胞膜等生物大分子的生物活性等特性,因此在精细化工、生物医药、生物 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
制造等领域将具有广泛的用途。羟基四氢嘧啶作为渗透保护剂比四氢嘧啶具有更大的优点：羟基四氢嘧啶作为酶的抗逆(抗热、抗冷冻、抗干燥等)保护剂性能优越[3,4];羟基四氢嘧啶在大肠杆菌长期保存过程中显著地减少了其菌株活力的降低;羟基四氢嘧啶还可以通过干扰疏水作用和PP键的相互作用,阻止在阿尔兹海默氏症发病机制中起着重要作用的AB42聚合体的形成[1,2]。
羟基四氢嘧啶在化妆品、食品、生物制剂和制药等领域具有广泛的应用前景。然而,羟基四氢嘧啶分子结构中含有两个手性碳原子，难以化学合成，因而其发酵生产越来越受到国内外学者的关注[6]。目前国内外学者对四氢嘧啶高产菌种筛选、发酵条件等方面进行了大量研究，初步建立了适合于四氢嘧啶生产的“细菌挤奶”工艺，但有关羟基四氢嘧啶的发酵生产的研究报道较少[9]。本课题的目的是分离筛选高产四氢嘧啶类相容性溶质的嗜盐微生物菌种，并对其合成四氢嘧啶类相容性溶质的发酵条件进行初步研究。
1 材料与方法
1.1培养基配方
乙酸培养基（g/L）：NaCl 100，NH4Cl 0.25，MgSO47H2O 0.25，K2HPO4 0.25，乙酸2，pH 7.5，121℃灭菌20 min。
1.2菌种分离与筛选
取各地盐碱地的盐土，经乙酸培养基富集培养后，经系列稀释和涂布分离，获得耐盐菌株, 将单菌落划线纯化后备用。将上述分离所得菌种，分别挑取单菌落接种于盛有100 mL乙酸培养基的三角瓶中，30℃摇床培养24 h，取1mL菌液两管, 离心（8000 rpm.4分钟）倒出上清液, 1号管加入0.5 mol.LNaOH 1mL溶解菌体用于菌体蛋白的测定，2号管加入1 mL80%乙醇静置过夜提取羟基四氢嘧啶, 离心取上清液采用HPLC测定四氢嘧啶类相容性溶质含量。
1.3菌种活化
从平板上挑取单菌落接种至100mL乙酸培养基，30℃摇床培养，至乙酸完全降解后按10%（V/V）接种量，即8mL菌液转接至72mL新鲜液体培养基中，连续转接2~3次备用。
1.4菌种发酵条件研究
1.4.1不同温度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响
取5个三角瓶，加入90 mL乙酸培养基和10 mL种子液，分别置20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，160 r/min摇床培养24 h，在后续培养过程中每6 h取样1次，每次从每个三角瓶中均匀吸取1 mL的菌液2份，8000 r/min离心4 min沉淀菌体，其中一份菌体用等体积的0.5 mol/L的NaOH溶解后用于菌体蛋白的测定，另一份用于四氢嘧啶类相容性溶质的提取与测定，根据所得结果计算菌体中四氢嘧啶类相容性溶质合成量，绘制温度—四氢嘧啶类相容性溶质合成量图表，确定最适温度。
1.4.2 不同pH对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响
取7个三角瓶，加入90 mL乙酸培养基和10 mL种子液，分别调节pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，160 r/min摇床培养24h，在后续培养过程中每6 h取样1次，每次从每个三角瓶中均匀吸取体积1 mL的菌液2份，8000 r/min离心4 min沉淀菌体，其中一份菌体用等体积的0.5 mol/L的NaOH溶解后用于菌体蛋白的测定，另一份用于四氢嘧啶类相容性溶质的提取与测定，最后根据所得结果计算菌体中四氢嘧啶类相容性溶质的合成量。绘制pH—四氢嘧啶类相容性溶质合成量图表，确定最适PH。
1.4.3 不同盐浓度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1培养基配方 2
1.2菌种分离与筛选 2
1.3菌种活化 2
1.4菌种发酵条件研究 2
1.4.1不同温度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响2
1.4.2不同pH对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响2
1.4.3不同盐浓度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响2
1.5分析方法3
1.5.1四氢嘧啶类相容性溶质的提取与HPLC测定方法3
1.5.2菌体蛋白测定方法（Lowry法）3
2结果分析3
2.1菌种的分离筛选3
2.2培养温度对菌株Y生长和相容性物质合成的影响4
2.3起始pH值对菌株Y生长和相容性物质合成的影响5
2.4盐浓度对菌株Y生长和相容性物质合成的影响 6
3 讨论7
致谢7
参考文献7
微生物合成四氢嘧啶类相容性溶质的初步研究
引言
引言
四氢嘧啶类（Ecs)物质是中度嗜盐菌应答较高渗透压而合成的相容性溶质,由于Ecs能够在高温、冷冻、干燥、射线、自由基等不利条件下保护酶、核酸、细胞膜等生物大分子的生物活性等特性,因此在精细化工、生物医药、生物 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
制造等领域将具有广泛的用途。羟基四氢嘧啶作为渗透保护剂比四氢嘧啶具有更大的优点：羟基四氢嘧啶作为酶的抗逆(抗热、抗冷冻、抗干燥等)保护剂性能优越[3,4];羟基四氢嘧啶在大肠杆菌长期保存过程中显著地减少了其菌株活力的降低;羟基四氢嘧啶还可以通过干扰疏水作用和PP键的相互作用,阻止在阿尔兹海默氏症发病机制中起着重要作用的AB42聚合体的形成[1,2]。
羟基四氢嘧啶在化妆品、食品、生物制剂和制药等领域具有广泛的应用前景。然而,羟基四氢嘧啶分子结构中含有两个手性碳原子，难以化学合成，因而其发酵生产越来越受到国内外学者的关注[6]。目前国内外学者对四氢嘧啶高产菌种筛选、发酵条件等方面进行了大量研究，初步建立了适合于四氢嘧啶生产的“细菌挤奶”工艺，但有关羟基四氢嘧啶的发酵生产的研究报道较少[9]。本课题的目的是分离筛选高产四氢嘧啶类相容性溶质的嗜盐微生物菌种，并对其合成四氢嘧啶类相容性溶质的发酵条件进行初步研究。
1 材料与方法
1.1培养基配方
乙酸培养基（g/L）：NaCl 100，NH4Cl 0.25，MgSO47H2O 0.25，K2HPO4 0.25，乙酸2，pH 7.5，121℃灭菌20 min。
1.2菌种分离与筛选
取各地盐碱地的盐土，经乙酸培养基富集培养后，经系列稀释和涂布分离，获得耐盐菌株, 将单菌落划线纯化后备用。将上述分离所得菌种，分别挑取单菌落接种于盛有100 mL乙酸培养基的三角瓶中，30℃摇床培养24 h，取1mL菌液两管, 离心（8000 rpm.4分钟）倒出上清液, 1号管加入0.5 mol.LNaOH 1mL溶解菌体用于菌体蛋白的测定，2号管加入1 mL80%乙醇静置过夜提取羟基四氢嘧啶, 离心取上清液采用HPLC测定四氢嘧啶类相容性溶质含量。
1.3菌种活化
从平板上挑取单菌落接种至100mL乙酸培养基，30℃摇床培养，至乙酸完全降解后按10%（V/V）接种量，即8mL菌液转接至72mL新鲜液体培养基中，连续转接2~3次备用。
1.4菌种发酵条件研究
1.4.1不同温度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响
取5个三角瓶，加入90 mL乙酸培养基和10 mL种子液，分别置20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，160 r/min摇床培养24 h，在后续培养过程中每6 h取样1次，每次从每个三角瓶中均匀吸取1 mL的菌液2份，8000 r/min离心4 min沉淀菌体，其中一份菌体用等体积的0.5 mol/L的NaOH溶解后用于菌体蛋白的测定，另一份用于四氢嘧啶类相容性溶质的提取与测定，根据所得结果计算菌体中四氢嘧啶类相容性溶质合成量，绘制温度—四氢嘧啶类相容性溶质合成量图表，确定最适温度。
1.4.2 不同pH对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响
取7个三角瓶，加入90 mL乙酸培养基和10 mL种子液，分别调节pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，160 r/min摇床培养24h，在后续培养过程中每6 h取样1次，每次从每个三角瓶中均匀吸取体积1 mL的菌液2份，8000 r/min离心4 min沉淀菌体，其中一份菌体用等体积的0.5 mol/L的NaOH溶解后用于菌体蛋白的测定，另一份用于四氢嘧啶类相容性溶质的提取与测定，最后根据所得结果计算菌体中四氢嘧啶类相容性溶质的合成量。绘制pH—四氢嘧啶类相容性溶质合成量图表，确定最适PH。
1.4.3 不同盐浓度对分离菌株生长及四氢嘧啶类物质合成的影响
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