约氏乳杆菌中油酸水合酶基因的克隆及重组表达
羟基脂肪酸分子中的羟基给予脂肪酸特别的性质，具有更高的反应活性，因此羟基脂肪酸在生物、食品、化工及绿色聚合物材料工业具有十分重要的应用前景，并受到国内外的日益高度关注。油酸是自然界含量最丰富的制备羟基脂肪酸的底物，此反应是由油酸水合酶催化完成的。本实验提取约氏乳杆菌中油酸水合酶基因，基因扩增后与质粒载体进行重组，并转化至大肠杆菌表达出油酸水合酶，催化油酸生成羟基脂肪酸，从而得到高产量羟基脂肪酸。另外，实验还将进行油酸水合酶基因的异源表达，实现特定菌种表达油酸水合酶的目的，扩大目的基因的菌种来源，满足油酸水合酶的大规模生产。关键词 油酸水合酶基因，基因克隆，基因重组，异源表达
目录
1绪论 1
1.1 约氏乳杆菌 1
1.1.1 约氏乳杆菌选择 1
1.2 油酸水合酶 3
1.2.1 水合酶作用机理 3
1.2.2 水合酶催化产物 3
1.2.3 水合酶研究现状 4
1.3 基因克隆与表达 4
1.4 小结 6
2 油酸水合酶异源表达 6
2.1 实验材料 6
2.1.1 实验菌种 6
2.1.2 实验试剂 6
2.1.3 实验仪器 7
2.2 实验方法 8
2.2.1 前期准备 8
2.2.2 油酸水合酶基因操作 8
2.2.4目的基因与载体进行连接 12
2.3 结果与分析 16
结 论 18
致 谢 19
参考文献 20
1绪论
脂肪酸是脂类的组成成分之一，在体内代谢过程中充当着重要的中间体。而且，羟基脂肪酸也是重要的生理活性物质如前列腺素，白三烯等的前体；同时，羟基基脂肪酸作为一种化工原料，在化工领域也拥有重要的应用地位。考虑到制备脂肪酸的经济性，应优先选择自然界含量丰富的原料[1]。自然界中最普遍的不饱和脂肪酸油酸(顺一9一十八碳烯酸)来源广泛。有人在1927年，就运用化学法将油酸在酸性条件下水解得到9和10羟基硬脂酸，羟基化的脂肪酸可以用作去污剂的成分，或者用于合成树脂，润滑 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
剂，表面活性剂和增塑剂[2]等化工用品。
油酸水合酶催化脂肪酸生成羟基脂肪酸。将长链不饱和脂肪酸进行选择性羟基化反应，在有机合成中仍然是一项非常具有挑战性的工作。因此，在有机合成中应用微生物源的不饱和羟化酶催化脂肪酸羟基化反应[3]，越来越受到重视。另外，由于微生物酶系种类和数量丰富，培养条件和环境比较容易，因此寻找可转化脂肪酸的羟基化反应的微生物来源，已经成为一种研究趋势。
本论文的研究目的，是将约氏乳杆菌中油酸水合酶基因提取出来并扩增，通过质粒载体转化至受体大肠杆菌中，表达出所需要的产物。实验取得成果后再将油酸水合酶基因进行目的菌株的异源表达，实现特定菌株大规模生产油酸水合酶目的。
1.1 约氏乳杆菌
1.1.1 约氏乳杆菌选择
由DNAMAN软件导出菌种进化树，分析同源相似性，选择约氏乳杆菌作为供体菌株。进化树如下：
图1 筛选菌种进化树
1.1.2约氏乳杆菌简介
约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，形状大都为长杆状，但有时乳酸杆菌有的为球状。约氏乳杆菌通常单独出现，少数表现为成对短链状。约氏乳杆菌是革兰氏阳性 菌，经革兰氏染色后呈紫色。约氏乳杆菌的最适生长温度为30℃，也可在10℃下生存。无荚膜，无芽孢，少有一些菌种以周生鞭毛进行运动。该乳酸杆菌为兼性厌氧菌，有时微好氧。有氧条件下，生长状态不好，可通过降低氧压，改善生长状况。约氏乳杆菌为化能异养菌，发酵分解糖代谢的产物主要为L(+)乳酸，不产气。在平板上培养的菌落，呈白色，球形或卵圆形凸起状，边缘较明显[4]。
约氏乳杆菌中含有所需的油酸水合酶基因，本实验研究的油酸水合酶基因则是从该菌株中提取。
1.2 油酸水合酶
1.2.1 水合酶作用机理
微生物源的水合酶(hydratases)能将水分子以顺式或反式的方式加合到不饱和脂肪酸碳碳双键上形成羟基脂肪酸。水合酶催化有机化合物的羟基化，是以水中的氧气作为氧化剂进行反应的，该催化过程不需要尼古丁酰胺辅因子。新的水合酶(如油酸酯水解酶)已从许多细菌细胞克隆出来，如脑膜炎败血伊丽莎白菌(原名假单胞菌株3266)，酿脓链球菌，双歧杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌[4]。水合酶一般催化顺9偶数脂肪酸和顺12偶数脂肪酸，不能催化不饱和脂肪酸的反式构型的羟基化。然而，目前还没有报告表明脂肪酸的生物转化过程适用于大规模生产。
1.2.2 水合酶催化产物
羟基脂肪酸，得名于脂肪酸分子的长链中碳位具有羟基基团，由脂肪酸为底物反应生成羟基脂肪酸的羟基化反应，是由油酸水合酶催化的。
图2 羟基化反应
脂肪酸是脂类的主要成分，是自然界中最丰富的可再生资源之一。脂肪酸可以作为原料，生产出多功能的化学物质。特别是，氧化脂肪酸被广泛用于制造香料、树脂、蜡、尼龙、塑料、润滑油、聚合物和添加剂在涂料和绘画。例如，蓖麻油酸是（12羟基9顺式十八烯酸）生物生产癸内酯的原料[5，6]。12羟基硬脂酸用于生产润滑油。ω羟基脂肪酸是合成一种独特的类聚乙烯生物基塑料的优秀单体。在不少研究中，相关研究人员已经发现，羟基脂肪酸分子中因为羟基的存在，给予了脂肪酸一定的特性。含有烯基、酯基和羟基等一些活性基团的分子，相比之下具有更高的反应活性。所以这些分子，被广泛应用于生产表面活性剂和化妆品，以及在食品工业中的抗菌剂和机械工业中，作为金属润滑剂、防锈剂等产品的重要的原料。
所以说，羟基脂肪酸在生物，化工以及食品行业具有广泛的应用前景，在国内外受到日益高度关注。
1.2.3 水合酶研究现状
含有脂肪酸双键水合酶的微生物，能够催化使用水生产羟基脂肪酸的含有顺式双键的不饱和脂肪酸的区域。这些选择性水合脂肪酸双键水合酶被称为油酸水合酶，因为它们在所检查的顺式9不饱和脂肪酸中显示出对油酸的最高水合活性，并且显示出对多不饱和脂肪酸，包括α亚麻酸和γ亚麻酸。然而，迄今为止尚未评估来自硝化梭菌的脂肪酸双键水合酶的底物特异性，因为关于编码该酶的基因的信息不可获得。因此，应进行该酶的基因克隆和表征以确定其确切的底物特异性。
目录
1绪论 1
1.1 约氏乳杆菌 1
1.1.1 约氏乳杆菌选择 1
1.2 油酸水合酶 3
1.2.1 水合酶作用机理 3
1.2.2 水合酶催化产物 3
1.2.3 水合酶研究现状 4
1.3 基因克隆与表达 4
1.4 小结 6
2 油酸水合酶异源表达 6
2.1 实验材料 6
2.1.1 实验菌种 6
2.1.2 实验试剂 6
2.1.3 实验仪器 7
2.2 实验方法 8
2.2.1 前期准备 8
2.2.2 油酸水合酶基因操作 8
2.2.4目的基因与载体进行连接 12
2.3 结果与分析 16
结 论 18
致 谢 19
参考文献 20
1绪论
脂肪酸是脂类的组成成分之一，在体内代谢过程中充当着重要的中间体。而且，羟基脂肪酸也是重要的生理活性物质如前列腺素，白三烯等的前体；同时，羟基基脂肪酸作为一种化工原料，在化工领域也拥有重要的应用地位。考虑到制备脂肪酸的经济性，应优先选择自然界含量丰富的原料[1]。自然界中最普遍的不饱和脂肪酸油酸(顺一9一十八碳烯酸)来源广泛。有人在1927年，就运用化学法将油酸在酸性条件下水解得到9和10羟基硬脂酸，羟基化的脂肪酸可以用作去污剂的成分，或者用于合成树脂，润滑 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
剂，表面活性剂和增塑剂[2]等化工用品。
油酸水合酶催化脂肪酸生成羟基脂肪酸。将长链不饱和脂肪酸进行选择性羟基化反应，在有机合成中仍然是一项非常具有挑战性的工作。因此，在有机合成中应用微生物源的不饱和羟化酶催化脂肪酸羟基化反应[3]，越来越受到重视。另外，由于微生物酶系种类和数量丰富，培养条件和环境比较容易，因此寻找可转化脂肪酸的羟基化反应的微生物来源，已经成为一种研究趋势。
本论文的研究目的，是将约氏乳杆菌中油酸水合酶基因提取出来并扩增，通过质粒载体转化至受体大肠杆菌中，表达出所需要的产物。实验取得成果后再将油酸水合酶基因进行目的菌株的异源表达，实现特定菌株大规模生产油酸水合酶目的。
1.1 约氏乳杆菌
1.1.1 约氏乳杆菌选择
由DNAMAN软件导出菌种进化树，分析同源相似性，选择约氏乳杆菌作为供体菌株。进化树如下：
图1 筛选菌种进化树
1.1.2约氏乳杆菌简介
约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，形状大都为长杆状，但有时乳酸杆菌有的为球状。约氏乳杆菌通常单独出现，少数表现为成对短链状。约氏乳杆菌是革兰氏阳性 菌，经革兰氏染色后呈紫色。约氏乳杆菌的最适生长温度为30℃，也可在10℃下生存。无荚膜，无芽孢，少有一些菌种以周生鞭毛进行运动。该乳酸杆菌为兼性厌氧菌，有时微好氧。有氧条件下，生长状态不好，可通过降低氧压，改善生长状况。约氏乳杆菌为化能异养菌，发酵分解糖代谢的产物主要为L(+)乳酸，不产气。在平板上培养的菌落，呈白色，球形或卵圆形凸起状，边缘较明显[4]。
约氏乳杆菌中含有所需的油酸水合酶基因，本实验研究的油酸水合酶基因则是从该菌株中提取。
1.2 油酸水合酶
1.2.1 水合酶作用机理
微生物源的水合酶(hydratases)能将水分子以顺式或反式的方式加合到不饱和脂肪酸碳碳双键上形成羟基脂肪酸。水合酶催化有机化合物的羟基化，是以水中的氧气作为氧化剂进行反应的，该催化过程不需要尼古丁酰胺辅因子。新的水合酶(如油酸酯水解酶)已从许多细菌细胞克隆出来，如脑膜炎败血伊丽莎白菌(原名假单胞菌株3266)，酿脓链球菌，双歧杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌[4]。水合酶一般催化顺9偶数脂肪酸和顺12偶数脂肪酸，不能催化不饱和脂肪酸的反式构型的羟基化。然而，目前还没有报告表明脂肪酸的生物转化过程适用于大规模生产。
1.2.2 水合酶催化产物
羟基脂肪酸，得名于脂肪酸分子的长链中碳位具有羟基基团，由脂肪酸为底物反应生成羟基脂肪酸的羟基化反应，是由油酸水合酶催化的。
图2 羟基化反应
脂肪酸是脂类的主要成分，是自然界中最丰富的可再生资源之一。脂肪酸可以作为原料，生产出多功能的化学物质。特别是，氧化脂肪酸被广泛用于制造香料、树脂、蜡、尼龙、塑料、润滑油、聚合物和添加剂在涂料和绘画。例如，蓖麻油酸是（12羟基9顺式十八烯酸）生物生产癸内酯的原料[5，6]。12羟基硬脂酸用于生产润滑油。ω羟基脂肪酸是合成一种独特的类聚乙烯生物基塑料的优秀单体。在不少研究中，相关研究人员已经发现，羟基脂肪酸分子中因为羟基的存在，给予了脂肪酸一定的特性。含有烯基、酯基和羟基等一些活性基团的分子，相比之下具有更高的反应活性。所以这些分子，被广泛应用于生产表面活性剂和化妆品，以及在食品工业中的抗菌剂和机械工业中，作为金属润滑剂、防锈剂等产品的重要的原料。
所以说，羟基脂肪酸在生物，化工以及食品行业具有广泛的应用前景，在国内外受到日益高度关注。
1.2.3 水合酶研究现状
含有脂肪酸双键水合酶的微生物，能够催化使用水生产羟基脂肪酸的含有顺式双键的不饱和脂肪酸的区域。这些选择性水合脂肪酸双键水合酶被称为油酸水合酶，因为它们在所检查的顺式9不饱和脂肪酸中显示出对油酸的最高水合活性，并且显示出对多不饱和脂肪酸，包括α亚麻酸和γ亚麻酸。然而，迄今为止尚未评估来自硝化梭菌的脂肪酸双键水合酶的底物特异性，因为关于编码该酶的基因的信息不可获得。因此，应进行该酶的基因克隆和表征以确定其确切的底物特异性。
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