一株普鲁兰酶产生菌的鉴定及其基因克隆和表达
摘要：普鲁兰酶作为一种解支酶，能够特异地作用于多糖中的 α- 1，6 糖苷键，将淀粉中高度分支的支链淀粉转变成直链淀粉,在实际工业生产中具有重要用途。本文通过从东海土中分离到的 3株产普鲁兰酶的菌株，提取基因组，克隆16srDNA并测序后，经 16srDNA 序列比对分析，该菌属于芽胞杆菌属(bacillus sp. )。通过普鲁兰酶的序列比对及设计引物，最终从该菌中克隆得到普鲁兰酶编码基因，全长 2 121 bp，编码 706 个氨基酸。并将该基因与克隆载体PET-23a连接，导入到大肠杆菌中进行表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验用具及试剂 2
1.1.2仪器2
1.1.3样品2
1.2实验步骤 3
1.2.1产普鲁兰酶菌株的基因组提取3
1.2.2 16S rDNA 序列分析，鉴定菌种3
1.2.3普鲁兰酶基因的克隆4
1.2.4普鲁兰酶基因的转化，测序4
1.2.5连接酶切位点合成引物5
1.2.6克隆普鲁兰酶基因，将基因连接T载体，转化后大量扩增质粒5
1.2.7 提取pET23a质粒 6
1.2.8构建重组质粒，导入大肠杆菌 6
2结果与分析7
2.1基因组电泳图7
2.2进化树图8
2.3 测试引物，退火温度电泳图 9
2.4扩大反应体系后基因电泳图 10
3讨论 11
致谢11
参考文献11
一株普鲁兰酶产生菌的鉴定及其基因克隆和表达
引言
引言：淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成,其中支链淀粉所占的比例为75% ～80%，这类淀粉水解消化的时候往往需要能够作用于 α 1，6 糖苷键的解支酶。普鲁兰酶就是一种解支酶，可专一性地水解普鲁兰糖而得名，能够以内切方式水解支链淀粉及多糖中的α 1，6 糖苷键，使支链淀粉脱支形成直链淀粉[1]。普
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
鲁兰酶的这种特性使其在食品、化工和制药等行业中有着广泛的应用和良好的市场前景。普鲁兰酶按作用位点的不同，可以分为两种类型:Ⅰ型普鲁兰酶和Ⅱ型普鲁兰酶[2] 。Ⅰ型普鲁兰酶(EC 3． 2． 1． 41)又称为限制性糊精酶、脱支酶或支链淀粉 6 葡聚糖水解酶，只水解多糖的α 1， 6 糖苷键。Ⅱ型普鲁兰酶也称淀粉普鲁兰酶(amylopullulanase，EC 3． 2． 1． 135)，不仅能够水解α 1， 6 糖苷键，也可以内切低聚糖的 α 1，4 糖苷键。普鲁兰糖(Pulullan)中文亦译为茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖,该糖是出芽孢梗霉产生的胞外多糖,以a一1,6一糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主,即葡萄糖按a一1,4一糖苷键结合成麦芽三糖,两端再以a一1,6一糖苷键同另外的麦芽三糖相结合,如此反复连接而成高分子多糖。
研究者已在多种微生物中分离纯化到普鲁兰酶［3 ，6 ］ 。不同来源的酶蛋白性质差异很大，大多数普鲁兰酶都是中温酶，个别具有耐高温的特性，如来源于 Thermotoga maritima 和 Bacillus sp． AN7 这两个菌的普鲁兰酶，最适反应温度均达到90℃ ［7， 8］ 。目前已有多种普鲁兰酶基因被分离克隆［9， 10 ］ ，并在大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等系统中进行了表达［11 ～14 ］ 。但是仅有丹麦诺维信公司的Bacillus acidopullulyticus ［15 ］ 和美国杰能科公司的Bacillus deramificans［16 ］ 菌株所产的普鲁兰酶应用在实际生产中。普鲁兰酶作为一种重要的糖苷水解酶，在淀粉加工、葡萄糖浆生产、麦芽糖浆生产、 啤酒生产和医药化工等方面具有巨大的应用价值。普鲁兰酶的单独使用可以将支链淀粉转变为直链淀粉,这种转化率可以达到100%。在淀粉的加工过程中,普鲁兰酶与糖化酶协同作用,能够加速糖化的过程，提高糖的利用率。另外普鲁兰酶还能与B一淀粉酶协同作用来可以提高麦芽糖的产量。同时普鲁兰酶可应用于饴糖生产,啤酒酿造,酒精生产制造,洗涤剂等工业。普鲁兰酶也可以用来研究碳水化合物的结构。由于普鲁兰酶这种新型的淀粉酶的广泛用途,该酶的研究和生产也日益受到世界各国的重视。
目前市场上使用的普鲁兰酶主要依赖进口，能够获得具有自主知识产权的普鲁兰酶， 并且实现其工业生产具有很重要的现实意义。本文通过筛选高温环境样品，从中分离到一株产普鲁兰酶的菌株，然后运用基因工程的方法克隆其中的普鲁兰酶基因，并将其导入到大肠杆菌中进行表达。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验器材及试剂
上海生工细菌基因组快速提取试剂盒
Magen琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(HiPure Gel Pure DNA Kits)
琼脂糖凝胶DNA回收离心方案（D2110/D2111）
Magen常规质粒提取试剂盒系列(HiPure Plasmid Kits)
HiPure Plasmid Mini Kits质粒提取方案（P1002）
BufferK
TaKaRaBamHⅠ
TaKaRaSacⅠ
1．1 .2 菌种和质粒
表达载体 pET 23a
克隆载体 pMD T19
大肠杆菌(Escherichia coli)
感受态细胞DH5a
土中筛选的未知菌种
1．1．3 仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
恒温磁力搅拌器（851 常州国华电器有限公司 常州）；
洁净工作台（SWCJ1FD 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 苏州）；
高速离心机（Eppendorf艾本德）；
数显恒温水浴锅（HH6 常州国华电器有限公司 常州）；t
立式高压灭菌锅(HVE50 HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION 日本)
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；
微型旋涡混合仪（XW80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验用具及试剂 2
1.1.2仪器2
1.1.3样品2
1.2实验步骤 3
1.2.1产普鲁兰酶菌株的基因组提取3
1.2.2 16S rDNA 序列分析，鉴定菌种3
1.2.3普鲁兰酶基因的克隆4
1.2.4普鲁兰酶基因的转化，测序4
1.2.5连接酶切位点合成引物5
1.2.6克隆普鲁兰酶基因，将基因连接T载体，转化后大量扩增质粒5
1.2.7 提取pET23a质粒 6
1.2.8构建重组质粒，导入大肠杆菌 6
2结果与分析7
2.1基因组电泳图7
2.2进化树图8
2.3 测试引物，退火温度电泳图 9
2.4扩大反应体系后基因电泳图 10
3讨论 11
致谢11
参考文献11
一株普鲁兰酶产生菌的鉴定及其基因克隆和表达
引言
引言：淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成,其中支链淀粉所占的比例为75% ～80%，这类淀粉水解消化的时候往往需要能够作用于 α 1，6 糖苷键的解支酶。普鲁兰酶就是一种解支酶，可专一性地水解普鲁兰糖而得名，能够以内切方式水解支链淀粉及多糖中的α 1，6 糖苷键，使支链淀粉脱支形成直链淀粉[1]。普
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
鲁兰酶的这种特性使其在食品、化工和制药等行业中有着广泛的应用和良好的市场前景。普鲁兰酶按作用位点的不同，可以分为两种类型:Ⅰ型普鲁兰酶和Ⅱ型普鲁兰酶[2] 。Ⅰ型普鲁兰酶(EC 3． 2． 1． 41)又称为限制性糊精酶、脱支酶或支链淀粉 6 葡聚糖水解酶，只水解多糖的α 1， 6 糖苷键。Ⅱ型普鲁兰酶也称淀粉普鲁兰酶(amylopullulanase，EC 3． 2． 1． 135)，不仅能够水解α 1， 6 糖苷键，也可以内切低聚糖的 α 1，4 糖苷键。普鲁兰糖(Pulullan)中文亦译为茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖,该糖是出芽孢梗霉产生的胞外多糖,以a一1,6一糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主,即葡萄糖按a一1,4一糖苷键结合成麦芽三糖,两端再以a一1,6一糖苷键同另外的麦芽三糖相结合,如此反复连接而成高分子多糖。
研究者已在多种微生物中分离纯化到普鲁兰酶［3 ，6 ］ 。不同来源的酶蛋白性质差异很大，大多数普鲁兰酶都是中温酶，个别具有耐高温的特性，如来源于 Thermotoga maritima 和 Bacillus sp． AN7 这两个菌的普鲁兰酶，最适反应温度均达到90℃ ［7， 8］ 。目前已有多种普鲁兰酶基因被分离克隆［9， 10 ］ ，并在大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等系统中进行了表达［11 ～14 ］ 。但是仅有丹麦诺维信公司的Bacillus acidopullulyticus ［15 ］ 和美国杰能科公司的Bacillus deramificans［16 ］ 菌株所产的普鲁兰酶应用在实际生产中。普鲁兰酶作为一种重要的糖苷水解酶，在淀粉加工、葡萄糖浆生产、麦芽糖浆生产、 啤酒生产和医药化工等方面具有巨大的应用价值。普鲁兰酶的单独使用可以将支链淀粉转变为直链淀粉,这种转化率可以达到100%。在淀粉的加工过程中,普鲁兰酶与糖化酶协同作用,能够加速糖化的过程，提高糖的利用率。另外普鲁兰酶还能与B一淀粉酶协同作用来可以提高麦芽糖的产量。同时普鲁兰酶可应用于饴糖生产,啤酒酿造,酒精生产制造,洗涤剂等工业。普鲁兰酶也可以用来研究碳水化合物的结构。由于普鲁兰酶这种新型的淀粉酶的广泛用途,该酶的研究和生产也日益受到世界各国的重视。
目前市场上使用的普鲁兰酶主要依赖进口，能够获得具有自主知识产权的普鲁兰酶， 并且实现其工业生产具有很重要的现实意义。本文通过筛选高温环境样品，从中分离到一株产普鲁兰酶的菌株，然后运用基因工程的方法克隆其中的普鲁兰酶基因，并将其导入到大肠杆菌中进行表达。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验器材及试剂
上海生工细菌基因组快速提取试剂盒
Magen琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(HiPure Gel Pure DNA Kits)
琼脂糖凝胶DNA回收离心方案（D2110/D2111）
Magen常规质粒提取试剂盒系列(HiPure Plasmid Kits)
HiPure Plasmid Mini Kits质粒提取方案（P1002）
BufferK
TaKaRaBamHⅠ
TaKaRaSacⅠ
1．1 .2 菌种和质粒
表达载体 pET 23a
克隆载体 pMD T19
大肠杆菌(Escherichia coli)
感受态细胞DH5a
土中筛选的未知菌种
1．1．3 仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
恒温磁力搅拌器（851 常州国华电器有限公司 常州）；
洁净工作台（SWCJ1FD 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 苏州）；
高速离心机（Eppendorf艾本德）；
数显恒温水浴锅（HH6 常州国华电器有限公司 常州）；t
立式高压灭菌锅(HVE50 HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION 日本)
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；
微型旋涡混合仪（XW80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
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