肺炎克雷伯菌噬菌体的分离与特性研究
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，K.p)是一种会危害人体健康，并且具有极强致病性的条件致病菌和医源性感染菌。加上抗生素在治疗细菌感染性疾病中的广泛应用造成细菌耐药性增强，加剧了由肺炎克雷伯菌等细菌引起的细菌性疾病的治疗难度，“后抗生素”时代的来临已成为现代医学中急需解决的严峻问题。噬菌体(Bacteriophage)类似于病毒，具备侵染和裂解细菌能力，它的优点是具有宿主专一性、无毒性、无诱导细菌耐药性等，有望部分替代抗生素成为治疗细菌感染性疾病的有效方法，渐渐被人类所重视。本研究以23株肺炎克雷伯菌为宿主菌，从南京不同地区的生活和医院污水中成功分离出多株肺炎克雷伯菌噬菌体，选择一株裂解能力较强和宿主谱较广的噬菌体，命名为pKP12-1，对其基本生物学特性进行了初步研究，旨在为研究噬菌体治疗肺炎克雷伯菌等细菌（特别是耐药和多重耐药细菌）引起的感染提供种质资源和理论参考。结果表明，噬菌体pKP12-1形成了直径3.5～5 mm的较大透明噬斑，具有裂解性噬菌体噬斑特征；基因组为双链DNA，大小约为25 Kb，具有NdeⅠ和EcoRV内切酶位点；滴度为5.1×1010 PFU/ml；最佳感染复数为0.01；宿主谱较广，对多株肺炎克雷伯菌敏感，裂解效率为43.5 %；一步生长曲线显示感染宿主菌的潜伏期约为15 min，裂解期约为45 min，裂解量为21 PFU/cell。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 供试菌株、污水样本、试剂、培养基和仪器设备 3
1.1.1 供试菌株 3
1.1.2 污水样本采集 3
1.1.3 试剂、培养基及其配方 3
1.1.4 仪器设备 3
1.2 污水样本噬菌体验证及筛选条件优化 3
1.2.1 宿主菌准备 3
1.2.2 污水样本处理 3
1.2.3 制备噬菌体原液 4
1.2.4 噬菌斑验证 4
1.2.5 噬菌体上清杂菌抗性培养基筛选 4
1.3 肺 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
炎克雷伯菌噬菌体初步分离纯化 4
1.3.1 污水上清溶液噬菌斑验证 4
1.4 肺炎克雷伯菌噬菌体基本生物学特性研究 5
1.4.1 肺炎克雷伯菌噬菌体滴度测定 5
1.4.2 肺炎克雷伯菌噬菌体最佳感染复数（MOI）测定 5
1.4.3 肺炎克雷伯菌噬菌体一步生长曲线的测定 5
1.4.4 肺炎克雷伯菌噬菌体宿主谱分析 5
1.4.5 肺炎克雷伯菌噬菌体成膜实验 5
1.5 肺炎克雷伯菌噬菌体分子生物学鉴定 5
1.5.1 从大规模裂解物中制备噬菌体颗粒 6
1.5.2 肺炎克雷伯菌噬菌体基因组DNA的提取 6
1.5.3 凝胶电泳测定噬菌体中DNA含量 6
1.5.4 噬菌体DNA的酶切 6
2 结果与分析 6
2.1 污水样本噬菌体验证及筛选分离条件优化 6
2.1.1 噬菌体上清杂菌抗性培养基筛选 7
2.1.2 CYSm选择性培养基抗菌效果验证 8
2.2 不同污水样本噬菌体分离及纯化 8
2.2.1 不同污水样本噬菌体验证 8
2.2.3 不同污水样本中噬菌体裂解不同肺炎克雷伯菌效果验证 9
2.2.4 不同污水样本中噬菌体分离纯化 10
2.3 肺炎克雷伯菌噬菌体生物学特性 11
2.3.1 不同污水样本噬菌体的筛选及形态学观察 11
2.3.2 肺炎克雷伯菌噬菌体宿主谱鉴定 12
2.3.3 肺炎克雷伯菌噬菌体最佳感染复数测定 13
2.3.4 肺炎克雷伯菌噬菌体一步生长曲线测定 13
2.3.5 肺炎克雷伯菌噬菌体成膜观察 14
2.4 肺炎克雷伯菌噬菌体pKP121基因组DNA提取及酶切分析 15
3 讨论 15
3.1 超级细菌 15
3.2 菌株的筛选 16
3.3 噬菌体晕环 16
3.4 噬菌体效价 16
3.5 噬菌体的最佳感染复数（MOI） 16
3.6 噬菌体的一步生长曲线 16
3.7 噬菌体的宿主谱 16
致谢 18
参考文献 19
肺炎克雷伯菌噬菌体的分离与特性研究
引言
引言 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，K.p）在分类学上属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），克雷伯菌属（Klebsiella），可细分为肺炎亚种（subsp. pneumoniae）、鼻炎亚种（subsp. azaenae）和鼻硬结亚种（subsp. rhinoscleromatis）。1893年，Friediander等人在患有肺炎病人的病变肺组织中成功分离出一株肺炎克雷伯菌，研究发现该菌为革兰氏阴性菌。广泛分布于自然环境中，对人和动物具有较强的致病性，侵染宿主后主要在呼吸道、肠道、泌尿生殖道中存活并大量繁殖，引起肺炎、泌尿系统发炎和全身败血症等相应器官病变，其高发病致死率给临床治疗造成极大困扰，成为严重危害人类生命健康的临床条件致病细菌[14]。肺炎克雷伯菌的易感人群主要包括新生儿和患有糖尿病、肿瘤等疾病的免疫力低下者[5]，经外科途径感染是该致病菌在易感人群中的主要传播途径，肺炎克雷伯菌是医院获得性肺炎（Hospital acquired pneumonia，HAP）的常见致病菌[6]，也是机械通气相关肺炎（Ventilator associated pneumonia，VAP）的五大致病菌之一[79]。加上抗生素的大量滥用，致使肺炎克雷伯菌耐药性增强，大大增加了肺炎克雷伯菌的致病性和治疗难度 [10,11]。
噬菌体（Bacteriophage）是一种能够侵染和裂解细菌的病毒，主要由蛋白质外壳和遗传物质核酸组成。1896年，Hankin在印度河水中分离到一种抗菌活性物质，发现其具有可通过细菌滤膜特性且耐热性很高[12]，1915年，Edward Twort等人研究发现这种活性物质很可能是某种病毒，1917年，科学家Felix d’Herelle将这种“杀细菌物质”命名为噬菌体（bacteriophage），并一直沿用至今[1315]。研究发现，噬菌体可以通过蛋白质外壳上的特异性配体与宿主细菌表面上的受体进行特异性的结合，并将其遗传物质注入宿主体内，然后借助宿主菌的代谢系统进行增殖，合成子代噬菌体来发挥作用。噬菌体可以根据其裂解特性分为裂解性噬菌体(lytic bacteriophage)和溶原性噬菌体(lysogenic bacteriophage)。裂解性噬菌体感染宿主细菌后，在宿主菌内大量增殖，最终宿主菌被裂解，释放出大量子代噬菌体，导致细菌死亡，噬菌体的这一特性是其应用于治疗细菌感染的有利条件[1618]。
在噬菌体发现之初，科学家d Herelle便将噬菌体应用于治疗痢疾和伤寒等细菌疾病的研究中[19]，Bruynoghe和Maisin率先应用噬菌体制剂治疗由葡萄球菌感染引起的皮肤疾病[20]，取得一系列明显效果。此后，噬菌体应用于各种细菌性疾病治疗研究进入了一个快速发展阶段，广泛应用于克雷伯菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、埃希杆菌和沙门菌等细菌性疾病的研究和临床治疗[21, 22]，取得了一系列研究成果。但由于噬菌体在临床治疗上存在宿主范围窄、纯度低（含有细菌内毒素等）、稳定性差、作用条件要求高等缺陷，再加上抗生素时代的到来和迅速发展，使得噬菌体在治疗细菌性疾病临床研究中的地位越来越低[2325]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 供试菌株、污水样本、试剂、培养基和仪器设备 3
1.1.1 供试菌株 3
1.1.2 污水样本采集 3
1.1.3 试剂、培养基及其配方 3
1.1.4 仪器设备 3
1.2 污水样本噬菌体验证及筛选条件优化 3
1.2.1 宿主菌准备 3
1.2.2 污水样本处理 3
1.2.3 制备噬菌体原液 4
1.2.4 噬菌斑验证 4
1.2.5 噬菌体上清杂菌抗性培养基筛选 4
1.3 肺 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
炎克雷伯菌噬菌体初步分离纯化 4
1.3.1 污水上清溶液噬菌斑验证 4
1.4 肺炎克雷伯菌噬菌体基本生物学特性研究 5
1.4.1 肺炎克雷伯菌噬菌体滴度测定 5
1.4.2 肺炎克雷伯菌噬菌体最佳感染复数（MOI）测定 5
1.4.3 肺炎克雷伯菌噬菌体一步生长曲线的测定 5
1.4.4 肺炎克雷伯菌噬菌体宿主谱分析 5
1.4.5 肺炎克雷伯菌噬菌体成膜实验 5
1.5 肺炎克雷伯菌噬菌体分子生物学鉴定 5
1.5.1 从大规模裂解物中制备噬菌体颗粒 6
1.5.2 肺炎克雷伯菌噬菌体基因组DNA的提取 6
1.5.3 凝胶电泳测定噬菌体中DNA含量 6
1.5.4 噬菌体DNA的酶切 6
2 结果与分析 6
2.1 污水样本噬菌体验证及筛选分离条件优化 6
2.1.1 噬菌体上清杂菌抗性培养基筛选 7
2.1.2 CYSm选择性培养基抗菌效果验证 8
2.2 不同污水样本噬菌体分离及纯化 8
2.2.1 不同污水样本噬菌体验证 8
2.2.3 不同污水样本中噬菌体裂解不同肺炎克雷伯菌效果验证 9
2.2.4 不同污水样本中噬菌体分离纯化 10
2.3 肺炎克雷伯菌噬菌体生物学特性 11
2.3.1 不同污水样本噬菌体的筛选及形态学观察 11
2.3.2 肺炎克雷伯菌噬菌体宿主谱鉴定 12
2.3.3 肺炎克雷伯菌噬菌体最佳感染复数测定 13
2.3.4 肺炎克雷伯菌噬菌体一步生长曲线测定 13
2.3.5 肺炎克雷伯菌噬菌体成膜观察 14
2.4 肺炎克雷伯菌噬菌体pKP121基因组DNA提取及酶切分析 15
3 讨论 15
3.1 超级细菌 15
3.2 菌株的筛选 16
3.3 噬菌体晕环 16
3.4 噬菌体效价 16
3.5 噬菌体的最佳感染复数（MOI） 16
3.6 噬菌体的一步生长曲线 16
3.7 噬菌体的宿主谱 16
致谢 18
参考文献 19
肺炎克雷伯菌噬菌体的分离与特性研究
引言
引言 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，K.p）在分类学上属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），克雷伯菌属（Klebsiella），可细分为肺炎亚种（subsp. pneumoniae）、鼻炎亚种（subsp. azaenae）和鼻硬结亚种（subsp. rhinoscleromatis）。1893年，Friediander等人在患有肺炎病人的病变肺组织中成功分离出一株肺炎克雷伯菌，研究发现该菌为革兰氏阴性菌。广泛分布于自然环境中，对人和动物具有较强的致病性，侵染宿主后主要在呼吸道、肠道、泌尿生殖道中存活并大量繁殖，引起肺炎、泌尿系统发炎和全身败血症等相应器官病变，其高发病致死率给临床治疗造成极大困扰，成为严重危害人类生命健康的临床条件致病细菌[14]。肺炎克雷伯菌的易感人群主要包括新生儿和患有糖尿病、肿瘤等疾病的免疫力低下者[5]，经外科途径感染是该致病菌在易感人群中的主要传播途径，肺炎克雷伯菌是医院获得性肺炎（Hospital acquired pneumonia，HAP）的常见致病菌[6]，也是机械通气相关肺炎（Ventilator associated pneumonia，VAP）的五大致病菌之一[79]。加上抗生素的大量滥用，致使肺炎克雷伯菌耐药性增强，大大增加了肺炎克雷伯菌的致病性和治疗难度 [10,11]。
噬菌体（Bacteriophage）是一种能够侵染和裂解细菌的病毒，主要由蛋白质外壳和遗传物质核酸组成。1896年，Hankin在印度河水中分离到一种抗菌活性物质，发现其具有可通过细菌滤膜特性且耐热性很高[12]，1915年，Edward Twort等人研究发现这种活性物质很可能是某种病毒，1917年，科学家Felix d’Herelle将这种“杀细菌物质”命名为噬菌体（bacteriophage），并一直沿用至今[1315]。研究发现，噬菌体可以通过蛋白质外壳上的特异性配体与宿主细菌表面上的受体进行特异性的结合，并将其遗传物质注入宿主体内，然后借助宿主菌的代谢系统进行增殖，合成子代噬菌体来发挥作用。噬菌体可以根据其裂解特性分为裂解性噬菌体(lytic bacteriophage)和溶原性噬菌体(lysogenic bacteriophage)。裂解性噬菌体感染宿主细菌后，在宿主菌内大量增殖，最终宿主菌被裂解，释放出大量子代噬菌体，导致细菌死亡，噬菌体的这一特性是其应用于治疗细菌感染的有利条件[1618]。
在噬菌体发现之初，科学家d Herelle便将噬菌体应用于治疗痢疾和伤寒等细菌疾病的研究中[19]，Bruynoghe和Maisin率先应用噬菌体制剂治疗由葡萄球菌感染引起的皮肤疾病[20]，取得一系列明显效果。此后，噬菌体应用于各种细菌性疾病治疗研究进入了一个快速发展阶段，广泛应用于克雷伯菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、埃希杆菌和沙门菌等细菌性疾病的研究和临床治疗[21, 22]，取得了一系列研究成果。但由于噬菌体在临床治疗上存在宿主范围窄、纯度低（含有细菌内毒素等）、稳定性差、作用条件要求高等缺陷，再加上抗生素时代的到来和迅速发展，使得噬菌体在治疗细菌性疾病临床研究中的地位越来越低[2325]。
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