氨基酸调控地衣芽孢杆菌合成杆菌肽的机理研究(附件)
2018 年 5月2018 年 5月杆菌肽是一种新型理想的广谱抗生素，由于芽孢杆菌的发酵，广泛应用于国内外动物饲料中。本文研究了天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸分别在10 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L、70 mmol/L、90 mmol/L浓度下与在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h不同时间添加对杆菌肽的产量的影响。结果显示，天冬氨酸最适添加浓度为50 mmol/L，最适添加时间为0 h；谷氨酸最适添加浓度为10 mmol/L，最适添加时间为0 h；亮氨酸最适添加浓度为10 mmol/L，最适添加时间为16 h；异亮氨酸最适添加浓度为70 mmol/L，最适添加时间为20 h。关键词 杆菌肽，地衣芽孢杆菌，氨基酸，抗生素，效价
目 录
1 引言 1
1.1 杆菌肽的作用机理 1
1.2 杆菌肽的分子结构与生物合成 1
1.2.1 杆菌肽的分子结构 1
1.2.2 杆菌肽的生物合成 2
1.3 杆菌肽高产菌株的生产策略 3
1.3.1 诱变育种 3
1.3.2 代谢调控 3
1.4 杆菌肽的检测方法 3
1.5 课题研究的目的和意义 4
2.1实验材料 4
2.1.1实验菌株 4
2.1.2实验仪器与药品 4
2.1.3培养基及其制备 5
2.2实验方法 7
2.2.1杆菌肽标准曲线的绘制 7
2.2.2四种主要氨基酸不同浓度不同时间添加对杆菌肽产量的影响 9
3结果与讨论 11
3.1杆菌肽标准品的标准曲线绘制 11
3.1.1抑菌圈法 11
3.1.2高效液相色谱法测的标准曲线 12
3.2 不同时间添加不同浓度氨基酸样品发酵抑菌圈 13
3.2.1 天冬氨酸 13
3.2.2 谷氨酸 15
3.2.3 亮氨酸 17
3.2.4异亮氨酸 18
结论 21
致谢 22
参考文献 23
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
/> 1 引言
杆菌肽是从美国B.H.Johnson分离的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），并产生抗菌物质，最终产物从细菌发酵产物中分离出来。地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）是2003年由中华人民共和国农业部批准的饲料级别之一。它是产生孢子的兼性厌氧微生物，被归类为原核真核生物。地衣芽孢杆菌生长迅速且容易生长。它具有很强的应力张力，很强的抗挤压性能，耐高温性和耐酸碱性。它能分泌淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等酶的特性，因此广泛的应用，特别是在医药和畜牧业中，具有较高的应用价值。
1.1 杆菌肽的作用机理
杆菌肽又称为Bcitracine，枯草杆菌蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，是一种主要由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌合成产生的多肽抗生素。杆菌肽的抗菌谱与青霉素相似，可以有效地消灭许多克。产生阴性细菌阳性细菌以及一些革兰氏阴性细菌。有三种作用机制：首先，它们的复合物可以吸附到细菌细胞壁上，可以削弱去磷酸化作用，影响磷脂的作用，粘膜皮肤复合物可以传递到细胞壁的头皮叶上，从而抑制细胞壁的合成，细胞逐渐死亡；二是与游离磷酸盐结合在敏感细菌细胞膜脂蛋白上，导致细胞膜损伤，通透性增加，多种离子，氨基酸，湍流等外流；第三，干扰敏感细胞中原始血浆蛋白的合成，此外，杆菌肽还广泛用作二硫化物异构酶的IDE抑制剂。
1.2 杆菌肽的分子结构与生物合成
1.2.1 杆菌肽的分子结构
杆菌肽A的分子式为C66H103N17O16S，分子量为1470Da。它的结构是由12个氨基酸组成的多肽，N末端L异亮氨酸和L半胱氨酸形成噻唑环，L赖氨酸形成L天冬酰胺形成7氨基酸环结构[1]。这种独特的组成和独特的环结构使杆菌肽对蛋白水解的水解耐受并且也不受蛋白酶抑制剂的影响。
由于杆菌肽是用非核糖体方法合成的，杆菌肽具有许多同种型，包括杆菌肽A，B1，B2，B3，C1，C2，C3，E，F和其他不同组分，总的来说，B组分占总活性的95％。地衣芽孢杆菌肽A1是最活性最大的，B1和B2活性低于A1，A2和F活性不高，杆菌肽F是杆菌肽A氧化产物，噻唑环是恶唑酮环，具有毒性。
图1杆菌肽的分子结构式
1.2.2 杆菌肽的生物合成
所有聚丙烯抗生素都来自非核糖体合成途径，它们的生物合成不使用mRNA作为模板，并且不需要tRNA作为载体，而是使用一系列非核糖体酶合成酶（NRPS）的生物合成。NPSPS是目前已知的最大的具有分子量的酶并且在不依赖于核酸模板的巯基模板聚合酶机制的非核糖体机理下操作[2]。它识别特定的氨基酸并将它们直接连接形成多元醇链，然后将其甲基化，修饰，酸化，糖基化，杂环化和环化形成最终产物。与生物合成相关的基因通常具有以下特征：合成的基因，抗性基因和调控基因并排排列形成基因簇，这些基因簇可能含有一个或多个转录单元，这意味着合成的非核糖体皮肤表达的协调调节具有复杂的氨基酸组成和分子形式。分子量低，具有稳定的理化性质，具有多种生物活性特征[2]。
杆菌肽NPRS是12环合成肽的次级代谢产物。前体是主要代谢产生的各种氨基酸，主要有10种[18]，氨基前体前体是第一个变构体，然后是BacA生物合成多肽酶（598 kDa），BacB（297 kDa）和BacC（723 kDa）三个模块，由芽孢杆菌生物合成基因组编码，其12个前体氨基酸发生缩合。BacA，BacB和BacC分别由bacA（15.7 kb），bacB（7.8 kb）和bacC（19.0 kb）编码，这三个基因位于同一个操纵子中。BacA激活异亮氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，谷氨酸，异亮氨酸和五种氨基酸缩合的作用[18]，BacB和BacC激活剩余的赖氨酸，鸟氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，天冬氨酸等。它是硫解酶（BacT）的编码，负责释放肽链。BacABC基因存在形成TCSS的bacR和bacS的复杂因子[3]。
目 录
1 引言 1
1.1 杆菌肽的作用机理 1
1.2 杆菌肽的分子结构与生物合成 1
1.2.1 杆菌肽的分子结构 1
1.2.2 杆菌肽的生物合成 2
1.3 杆菌肽高产菌株的生产策略 3
1.3.1 诱变育种 3
1.3.2 代谢调控 3
1.4 杆菌肽的检测方法 3
1.5 课题研究的目的和意义 4
2.1实验材料 4
2.1.1实验菌株 4
2.1.2实验仪器与药品 4
2.1.3培养基及其制备 5
2.2实验方法 7
2.2.1杆菌肽标准曲线的绘制 7
2.2.2四种主要氨基酸不同浓度不同时间添加对杆菌肽产量的影响 9
3结果与讨论 11
3.1杆菌肽标准品的标准曲线绘制 11
3.1.1抑菌圈法 11
3.1.2高效液相色谱法测的标准曲线 12
3.2 不同时间添加不同浓度氨基酸样品发酵抑菌圈 13
3.2.1 天冬氨酸 13
3.2.2 谷氨酸 15
3.2.3 亮氨酸 17
3.2.4异亮氨酸 18
结论 21
致谢 22
参考文献 23
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
/> 1 引言
杆菌肽是从美国B.H.Johnson分离的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），并产生抗菌物质，最终产物从细菌发酵产物中分离出来。地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）是2003年由中华人民共和国农业部批准的饲料级别之一。它是产生孢子的兼性厌氧微生物，被归类为原核真核生物。地衣芽孢杆菌生长迅速且容易生长。它具有很强的应力张力，很强的抗挤压性能，耐高温性和耐酸碱性。它能分泌淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等酶的特性，因此广泛的应用，特别是在医药和畜牧业中，具有较高的应用价值。
1.1 杆菌肽的作用机理
杆菌肽又称为Bcitracine，枯草杆菌蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，是一种主要由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌合成产生的多肽抗生素。杆菌肽的抗菌谱与青霉素相似，可以有效地消灭许多克。产生阴性细菌阳性细菌以及一些革兰氏阴性细菌。有三种作用机制：首先，它们的复合物可以吸附到细菌细胞壁上，可以削弱去磷酸化作用，影响磷脂的作用，粘膜皮肤复合物可以传递到细胞壁的头皮叶上，从而抑制细胞壁的合成，细胞逐渐死亡；二是与游离磷酸盐结合在敏感细菌细胞膜脂蛋白上，导致细胞膜损伤，通透性增加，多种离子，氨基酸，湍流等外流；第三，干扰敏感细胞中原始血浆蛋白的合成，此外，杆菌肽还广泛用作二硫化物异构酶的IDE抑制剂。
1.2 杆菌肽的分子结构与生物合成
1.2.1 杆菌肽的分子结构
杆菌肽A的分子式为C66H103N17O16S，分子量为1470Da。它的结构是由12个氨基酸组成的多肽，N末端L异亮氨酸和L半胱氨酸形成噻唑环，L赖氨酸形成L天冬酰胺形成7氨基酸环结构[1]。这种独特的组成和独特的环结构使杆菌肽对蛋白水解的水解耐受并且也不受蛋白酶抑制剂的影响。
由于杆菌肽是用非核糖体方法合成的，杆菌肽具有许多同种型，包括杆菌肽A，B1，B2，B3，C1，C2，C3，E，F和其他不同组分，总的来说，B组分占总活性的95％。地衣芽孢杆菌肽A1是最活性最大的，B1和B2活性低于A1，A2和F活性不高，杆菌肽F是杆菌肽A氧化产物，噻唑环是恶唑酮环，具有毒性。
图1杆菌肽的分子结构式
1.2.2 杆菌肽的生物合成
所有聚丙烯抗生素都来自非核糖体合成途径，它们的生物合成不使用mRNA作为模板，并且不需要tRNA作为载体，而是使用一系列非核糖体酶合成酶（NRPS）的生物合成。NPSPS是目前已知的最大的具有分子量的酶并且在不依赖于核酸模板的巯基模板聚合酶机制的非核糖体机理下操作[2]。它识别特定的氨基酸并将它们直接连接形成多元醇链，然后将其甲基化，修饰，酸化，糖基化，杂环化和环化形成最终产物。与生物合成相关的基因通常具有以下特征：合成的基因，抗性基因和调控基因并排排列形成基因簇，这些基因簇可能含有一个或多个转录单元，这意味着合成的非核糖体皮肤表达的协调调节具有复杂的氨基酸组成和分子形式。分子量低，具有稳定的理化性质，具有多种生物活性特征[2]。
杆菌肽NPRS是12环合成肽的次级代谢产物。前体是主要代谢产生的各种氨基酸，主要有10种[18]，氨基前体前体是第一个变构体，然后是BacA生物合成多肽酶（598 kDa），BacB（297 kDa）和BacC（723 kDa）三个模块，由芽孢杆菌生物合成基因组编码，其12个前体氨基酸发生缩合。BacA，BacB和BacC分别由bacA（15.7 kb），bacB（7.8 kb）和bacC（19.0 kb）编码，这三个基因位于同一个操纵子中。BacA激活异亮氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，谷氨酸，异亮氨酸和五种氨基酸缩合的作用[18]，BacB和BacC激活剩余的赖氨酸，鸟氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，天冬氨酸等。它是硫解酶（BacT）的编码，负责释放肽链。BacABC基因存在形成TCSS的bacR和bacS的复杂因子[3]。
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