牦牛酸奶中乳酸菌的分离鉴定以及乳酸杆菌冻干工艺探究
摘要：西藏牦牛酸奶因其口感粘稠，风味独特，深受广大消费者的喜爱。究其原因，就是因为其自然发酵菌种的独特性。因此，探酸奶中所含菌种就成为深入研究其产品特性的起点。本实验通过比较乳酸菌属内专性同型发酵的种的鉴别特征的不同来鉴别同属不同种的菌种，对比16sDNA分子测序的方法，其优点为快速，准确，经济。能直观的确定被测菌的菌种。冷冻干燥是各种益生菌干燥的主要方式。随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展，积极研究乳酸菌的冻干技术和动感过程保护剂的选择对推动我国乳酸菌发酵剂产业化进程、促进我国发酵乳制品工业的发展，具有重要意义。本实验初步探索了乳酸菌在冷冻干燥过程中存活的适宜条件;在保护剂筛选中，针对乳酸菌的特性选取多种保护剂进行实验，筛选出优良冻干复合保护剂配方，乳清蛋白粉10%，海藻糖4%，维生素C3%，谷氨酸钠0.5%(均为质量分数)，此保护剂对保加利亚乳杆菌的冻干存活率达到89.10 %。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 原料2
1.1.2 试验用培养基3
1.1.3 主要仪器与设备4
1.2 实验方法4
1.2.1 乳酸杆菌的分离与鉴定4
1.2.1.1 菌种的分离与纯化4
1.2.1.2 菌种的鉴定4
1.2.2 乳酸杆菌冻干工艺的探究5
1.2.2.1 最优配比复配保护剂的筛选5
1.2.2.1.1实验前准备6
1.2.2.1.2 实验设计6
1.2.2.2 最佳冻干方式的选择6
1.2.2.2.1 实验方法6
2 结果与分析6
2.1 菌落形态的观察6
2.2 菌种的鉴定结果7
2.3 最优配比复配冻干保护剂的配比8
2.4 最优预冻方式的实验结果9
3 分析与讨论9
4 致谢 10
5 参考文献 10
牦牛酸奶中乳酸菌的分离鉴定以及乳酸菌冻干工艺的探究
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
引言
引言
牦牛酸奶多由牧民自己制作，没有标准化的方法。微小的环境变化都会影响酸奶的风味，也就造成的不同地区酸奶品质不一的情况。西藏牧民家庭的发 酵牛乳在微生物组成上比较复杂。它除了含有一般发酵乳中所含的益生菌外，少数牛乳中还含有芽孢菌。众所周知，某些芽孢菌经过巴氏杀菌或其他的热处理后仍可继续存活，因此芽孢菌的存在增加了发酵牛乳卫生安全的风险[1]。牦牛酸奶中存在芽孢菌，说明牛乳的卫生质量堪忧。所以，在某种程度上讲，经饮用牦牛酸奶存在一定的健康风险，如果产业不能统一生产标准，消费者最好能长时间在同一处购买，以便降低风险。
乳酸菌的益生功效显著，但各菌种的具体作用不尽相同。所以，作为基础研究，乳酸菌的分类鉴别研究又显得尤为重要。
冷冻干燥（freezedry）是一种将含水物料在低温下冷冻，然后在真空条件下升华，去除水分从而使样品出于干燥状态的单元操作。乳杆菌在食品工业中主要是作为发酵剂使用。物料可用液体、冷冻、喷雾干燥或冷冻干燥等形式，在以上的保藏方法中，冷冻干燥法是最为有效的方法之一。
物质中所含水分主要以结构水和游离水两种形式存在。冷冻干燥主要是升华游离水[2]。当压力增加时，冰的熔点降低。三相平衡点时表示在这个温度和压力时，冰、水、汽三相同时共存。冷冻干燥是一种将样品在低温下冷冻，然后在真空条件下升华，去除水分从而使样品出于干燥状态的单元操作。
尽管冷冻干燥有许多优点，但它会对乳酸菌细胞造成一定的生理损伤，降低细胞存活率，主要表现在冻结过程中冰晶的机械损伤、冻结及干燥过程中引起的溶质损伤、冷冻干燥前后细胞膜的结构、功能及成分的变化、关键酶失活、DNA结构的变化等[3]。所以预冻方式的选择，保护剂的选择对于细菌存活率的影响显得尤为重要。
本实验采用液氮预冻的方式，取代普通预冻。原因在于液氮在标准大气压下沸点为183摄氏度，相对于冻干机的预冻程序能将细菌细胞急速冷却，使细胞内难以形成大的冰晶，从而提高菌种的复活率。而复配保护剂相对于单一保护剂又有很多优点，所以本实验会从这两面着手探究冻干工艺的选择对菌种复活率的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
牦牛酸奶：购于西藏地区普通牧民家庭。桶装，放置于4℃冰箱中储存。
1.1.2 试验用培养基
表1：mrs培养基配方
Mrs培养基
成分
g/1000ml
蛋白胨
牛肉膏
酵母膏
磷酸氢二钾
柠檬酸铵
乙酸钠
葡萄糖
吐温
硫酸镁
Ph:6.87.0
10
10
5
2
2
5
20
1
0.25
表二：Elicker培养基配方
Elicker培养基
成分
g/1000ml
胰蛋白胨
蔗糖
酵母粉
氯化钠
明胶
乙酸钠
葡萄糖
抗坏血酸
乳糖
20
5
5
4
2.5
1.5
5
0.5
5
表三：Lbs培养基配方
Lbs培养基
成分
g/1000ml
酵母浸粉
胰酪蛋白胨
磷酸二氢钾
硫酸亚铁
硫酸镁
葡萄糖
乙酸钠
柠檬酸铵
硫酸锰
Ph：5.35.7
5
10
6
0.034
0.575
20
25
2
0.12
表四：py培养基配方
Py培养基
成分
g/1000ml
蛋白胨
胰酪蛋白胨
酵母提取物
无水氯化钙
硫酸镁
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
碳酸氢钠
氯化钠
5
5
10
0.008
0.0192
0.04
0.01
0.4
0.08
1.1.3 主要仪器与设备
AY120分析天平，日本SHIMADZU集团；kf电子天平，浙江凯丰集团有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，DRP9162型生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；Avanti JE冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；E100光学显微镜，日本尼康公司生产；delta 320 ph仪，梅特勒托利多（上海）有限公司生产；漩涡混合器，DHG9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SWCJ2F单人单面超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；微波炉,广东格兰仕微波炉电器制造有限公司;冰箱,西门子电器有限公司；冻干机。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 原料2
1.1.2 试验用培养基3
1.1.3 主要仪器与设备4
1.2 实验方法4
1.2.1 乳酸杆菌的分离与鉴定4
1.2.1.1 菌种的分离与纯化4
1.2.1.2 菌种的鉴定4
1.2.2 乳酸杆菌冻干工艺的探究5
1.2.2.1 最优配比复配保护剂的筛选5
1.2.2.1.1实验前准备6
1.2.2.1.2 实验设计6
1.2.2.2 最佳冻干方式的选择6
1.2.2.2.1 实验方法6
2 结果与分析6
2.1 菌落形态的观察6
2.2 菌种的鉴定结果7
2.3 最优配比复配冻干保护剂的配比8
2.4 最优预冻方式的实验结果9
3 分析与讨论9
4 致谢 10
5 参考文献 10
牦牛酸奶中乳酸菌的分离鉴定以及乳酸菌冻干工艺的探究
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
引言
引言
牦牛酸奶多由牧民自己制作，没有标准化的方法。微小的环境变化都会影响酸奶的风味，也就造成的不同地区酸奶品质不一的情况。西藏牧民家庭的发 酵牛乳在微生物组成上比较复杂。它除了含有一般发酵乳中所含的益生菌外，少数牛乳中还含有芽孢菌。众所周知，某些芽孢菌经过巴氏杀菌或其他的热处理后仍可继续存活，因此芽孢菌的存在增加了发酵牛乳卫生安全的风险[1]。牦牛酸奶中存在芽孢菌，说明牛乳的卫生质量堪忧。所以，在某种程度上讲，经饮用牦牛酸奶存在一定的健康风险，如果产业不能统一生产标准，消费者最好能长时间在同一处购买，以便降低风险。
乳酸菌的益生功效显著，但各菌种的具体作用不尽相同。所以，作为基础研究，乳酸菌的分类鉴别研究又显得尤为重要。
冷冻干燥（freezedry）是一种将含水物料在低温下冷冻，然后在真空条件下升华，去除水分从而使样品出于干燥状态的单元操作。乳杆菌在食品工业中主要是作为发酵剂使用。物料可用液体、冷冻、喷雾干燥或冷冻干燥等形式，在以上的保藏方法中，冷冻干燥法是最为有效的方法之一。
物质中所含水分主要以结构水和游离水两种形式存在。冷冻干燥主要是升华游离水[2]。当压力增加时，冰的熔点降低。三相平衡点时表示在这个温度和压力时，冰、水、汽三相同时共存。冷冻干燥是一种将样品在低温下冷冻，然后在真空条件下升华，去除水分从而使样品出于干燥状态的单元操作。
尽管冷冻干燥有许多优点，但它会对乳酸菌细胞造成一定的生理损伤，降低细胞存活率，主要表现在冻结过程中冰晶的机械损伤、冻结及干燥过程中引起的溶质损伤、冷冻干燥前后细胞膜的结构、功能及成分的变化、关键酶失活、DNA结构的变化等[3]。所以预冻方式的选择，保护剂的选择对于细菌存活率的影响显得尤为重要。
本实验采用液氮预冻的方式，取代普通预冻。原因在于液氮在标准大气压下沸点为183摄氏度，相对于冻干机的预冻程序能将细菌细胞急速冷却，使细胞内难以形成大的冰晶，从而提高菌种的复活率。而复配保护剂相对于单一保护剂又有很多优点，所以本实验会从这两面着手探究冻干工艺的选择对菌种复活率的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
牦牛酸奶：购于西藏地区普通牧民家庭。桶装，放置于4℃冰箱中储存。
1.1.2 试验用培养基
表1：mrs培养基配方
Mrs培养基
成分
g/1000ml
蛋白胨
牛肉膏
酵母膏
磷酸氢二钾
柠檬酸铵
乙酸钠
葡萄糖
吐温
硫酸镁
Ph:6.87.0
10
10
5
2
2
5
20
1
0.25
表二：Elicker培养基配方
Elicker培养基
成分
g/1000ml
胰蛋白胨
蔗糖
酵母粉
氯化钠
明胶
乙酸钠
葡萄糖
抗坏血酸
乳糖
20
5
5
4
2.5
1.5
5
0.5
5
表三：Lbs培养基配方
Lbs培养基
成分
g/1000ml
酵母浸粉
胰酪蛋白胨
磷酸二氢钾
硫酸亚铁
硫酸镁
葡萄糖
乙酸钠
柠檬酸铵
硫酸锰
Ph：5.35.7
5
10
6
0.034
0.575
20
25
2
0.12
表四：py培养基配方
Py培养基
成分
g/1000ml
蛋白胨
胰酪蛋白胨
酵母提取物
无水氯化钙
硫酸镁
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
碳酸氢钠
氯化钠
5
5
10
0.008
0.0192
0.04
0.01
0.4
0.08
1.1.3 主要仪器与设备
AY120分析天平，日本SHIMADZU集团；kf电子天平，浙江凯丰集团有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，DRP9162型生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；Avanti JE冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；E100光学显微镜，日本尼康公司生产；delta 320 ph仪，梅特勒托利多（上海）有限公司生产；漩涡混合器，DHG9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SWCJ2F单人单面超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；微波炉,广东格兰仕微波炉电器制造有限公司;冰箱,西门子电器有限公司；冻干机。
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