鸡hnf6基因的克隆及其重组蛋白的表达【字数：10591】
摘 要Hnf6即肝细胞核因子6，属于ONECUT蛋白家族，在肝脏中表达量较高，可以调控肝细胞特异性的表达。研究发现它不但参与肝脏的发育调控过程和肿瘤的生理及病理过程，而且还对生物体的脂质分解和合成代谢具有重要作用。本课题从鸡肝中的RT产物中扩增得到了目的基因Hnf6片段，并将Hnf6基因片段连接克隆到原核表达载体pCold III中，成功构建出了pCold III-Hnf6表达载体。在BL21（DE3）大肠杆菌中进行HNF6重组蛋白的工程性表达。SDS-PAGE检测结果显示，重组菌在15℃条件下150 rpm进行IPTG浓度梯度诱导培养24 h，与未诱导的相比，成功得到了大小为49 KDa重组蛋白HNF6，且重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达。利用8 mol/L的尿素对包涵体进行变性，采用Ni离子亲和层析吸附重组蛋白，以逐步去除尿素进行重组蛋白的复性，得到较高纯度的、可溶性重组蛋白，这为进一步研究Hnf6基因的结构和功能及其在鸡的肝脏发育和代谢过程中的作用打下了基础。
目 录
1 前言 1
2 材料与方法 3
2.1实验质粒和菌株 3
2.2 实验试剂 3
2.3 实验仪器 3
2.4试剂的配制 3
2.5引物合成 3
2.6实验方法 3
2.6.1鸡Hnf6基因的获取和扩增 3
2.6.2原核表达载体pCold III的构建 5
2.6.3鸡BL21 pCold IIIHnf6重组表达菌的构建和重组蛋白诱导表达 7
2.6.4重组蛋白的表达方式检测 8
2.6.5重组蛋白的纯化 8
3 结果与分析 11
3.1鸡Hnf6基因的扩增结果 11
3.2鸡Hnf6基因的pCold III原核表达载体的构建 11
3.3 BL21 pCold IIIHnf6重组表达菌的构建及表达方式的检测 12
3.4 HNF6重组蛋白的纯化 15
4 讨论 18
5 结论 20
参考文献 21
致谢 23
附录1 24
1 前言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
HNFs，即肝细胞核因子，它是一种转录因子，主要作用是调节肝脏内基因的特异性表达，其家族中包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6及C/EBP这五个成员，它们对于控制肝脏的发育和肝细胞的功能起着重要的作用[1]。
HNF6即细胞核因子6，其作为肝细胞核因子的ONECUT蛋白家族之一，对于生物体的肝脏和胰岛起着重要得调控作用，并且还影响着器官的发育和组织再生过程[2]。Hnf6基因还参与胆管细胞的增殖分化过程，并且可以发挥作用来维持胆管上皮细胞的形态。因此，它对胆管的发育和形成至关重要[3]。同时HNF6还能够利用细胞的生长周期来调控基因的特异性转录从而刺激肝细胞发生增殖。研究表明，Hnf6基因的表达水平明显增高当在肝脏的生长增殖过程中[4]。若肝脏发生损伤，其一个基本反应则表现为肝组织的再生，这一现象就是一些生长因子和细胞因子参与而发生的，HNF6正为这些调控肝脏再生的因子之一。同时，从一些研究中可以看出，Hnf6基因还与肿瘤的代谢有着密切的联系。比如说在肝脏的发育过程中，可以发现Hnf6在胆管上皮细胞中含量丰富，而胆管癌就起源于胆管上皮细胞，所以说明HNF6参与胆管癌(CCA)细胞生长和转移[5]。并且作为影响基因特异性的一类转录因子，目前已经发现Hnf6调控多种靶基因的转录，其中多数靶基因即为转录因子且已被发现它们大多都参与恶性肿瘤的生长与转移过程[6]。结直肠癌是这些常见的恶性肿瘤之一。经过检测，HNF6在显示结直肠癌转移的标本中被检测到表达上调，而在正常结肠和其他形式的结肠癌中并无此现象出现[7]。这就证明了HNF6在结直肠癌疾病中对肿瘤的生长起效果，并且导致的并发症表现为肝转移，从而最终导致肝衰竭[8]。并且，若是HNF6翻译后缺乏修饰，则会使得蛋白质无法与DNA结合[9]。而Hnf6基因的过表达则可以刺激靶基因Foxa2的表达，靶基因Foxa2在肝脏的发育和分化方面具有非常重要的作用，因此Hnf6基因可以通过调控靶基因Foxa2从而恢复Hnf6的活性而抑制肿瘤生长[10]。此外，Hnf6基因还参与调节葡萄糖水平和胆固醇代谢过程。HNF6身为一种转录激活因子，其肝缺失可以上调众多的脂肪生成基因的表达。这些脂肪生成基因中有许多是生物钟状核受体Reverbα的靶点，当Hnf6在肝脏中缺失时，Reverbα也会丧失在这些位点上的结合能力。因此Hnf6和Reverbα可以协同调节肝脏脂质代谢[11]。所以，进行Hnf6基因的研究对于生物体的脂质代谢和脂肪合成具有重要作用。
本研究采用了原核载体表达技术。大肠杆菌表达系统在众多表达系统中是最早被采用进行研究的表达系统，它也是目前掌握的所有表达系统中研究方法最成熟的表达系统。它所具有的众多优点使之成为了生产重组蛋白的最常用的系统[12]。而本实验使用的原核表达载体pCold III是pCold系列载体中的成员之一，pCold系列载体包括pCold IIV，主要是在大肠杆菌基因中构建插入冷休克基因CspA启动子序列的原核表达系统。它是在冷休克基因CspA启动子设计高效率蛋白质表达载体。并且在CspA的启动子的下游端，插入了lac操纵子，此外，5非翻译区（5ΜTR）、翻译增强元件（TEE）、His标签序列，Xa因子切割位点和多克隆位点（MCS）同样也处于CspA启动子的下游端，以便能够准确控制表达情况。它可以利用大肠杆菌的低温表达基因使大肠杆菌在低温下暂停生长，从而使大部分基因的表达量下降，但冷休克表达载体却可被诱导表达。从而解决了表达蛋白不可溶的问题[13]。pCold III的冷休克特性使它不仅可以在高温下外源基因可以高效表达，而且当低温诱导蛋白表达时，低温抑制了大肠杆菌自身的蛋白质合成，从而使目的蛋白获得较高的表达[14]。并且其在低温中可以被IPTG诱导剂诱导表达，增强了目的蛋白的稳定性表达，且有效促进融合蛋白的可溶性表达，使得蛋白质方便进行高效纯化[15]。
目前对Hnf6基因的研究已有了很大进展，为了探索Hnf6基因在鸡的肝脏的发育和脂质代谢的调控过程，本研究通过基因工程和分子生物学的原理，从鸡肝组织的RT产物中克隆出Hnf6基因，并构建其原核表达载体pCold IIIHnf6，通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达HNF6重组蛋白，为进一步研究HNF6蛋白的结构和功能以及制备抗体提供足够的重组蛋白，为研究其在在鸡的肝脏发育和脂质代谢过程中的作用打下基础。
2 材料与方法
目 录
1 前言 1
2 材料与方法 3
2.1实验质粒和菌株 3
2.2 实验试剂 3
2.3 实验仪器 3
2.4试剂的配制 3
2.5引物合成 3
2.6实验方法 3
2.6.1鸡Hnf6基因的获取和扩增 3
2.6.2原核表达载体pCold III的构建 5
2.6.3鸡BL21 pCold IIIHnf6重组表达菌的构建和重组蛋白诱导表达 7
2.6.4重组蛋白的表达方式检测 8
2.6.5重组蛋白的纯化 8
3 结果与分析 11
3.1鸡Hnf6基因的扩增结果 11
3.2鸡Hnf6基因的pCold III原核表达载体的构建 11
3.3 BL21 pCold IIIHnf6重组表达菌的构建及表达方式的检测 12
3.4 HNF6重组蛋白的纯化 15
4 讨论 18
5 结论 20
参考文献 21
致谢 23
附录1 24
1 前言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
HNFs，即肝细胞核因子，它是一种转录因子，主要作用是调节肝脏内基因的特异性表达，其家族中包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6及C/EBP这五个成员，它们对于控制肝脏的发育和肝细胞的功能起着重要的作用[1]。
HNF6即细胞核因子6，其作为肝细胞核因子的ONECUT蛋白家族之一，对于生物体的肝脏和胰岛起着重要得调控作用，并且还影响着器官的发育和组织再生过程[2]。Hnf6基因还参与胆管细胞的增殖分化过程，并且可以发挥作用来维持胆管上皮细胞的形态。因此，它对胆管的发育和形成至关重要[3]。同时HNF6还能够利用细胞的生长周期来调控基因的特异性转录从而刺激肝细胞发生增殖。研究表明，Hnf6基因的表达水平明显增高当在肝脏的生长增殖过程中[4]。若肝脏发生损伤，其一个基本反应则表现为肝组织的再生，这一现象就是一些生长因子和细胞因子参与而发生的，HNF6正为这些调控肝脏再生的因子之一。同时，从一些研究中可以看出，Hnf6基因还与肿瘤的代谢有着密切的联系。比如说在肝脏的发育过程中，可以发现Hnf6在胆管上皮细胞中含量丰富，而胆管癌就起源于胆管上皮细胞，所以说明HNF6参与胆管癌(CCA)细胞生长和转移[5]。并且作为影响基因特异性的一类转录因子，目前已经发现Hnf6调控多种靶基因的转录，其中多数靶基因即为转录因子且已被发现它们大多都参与恶性肿瘤的生长与转移过程[6]。结直肠癌是这些常见的恶性肿瘤之一。经过检测，HNF6在显示结直肠癌转移的标本中被检测到表达上调，而在正常结肠和其他形式的结肠癌中并无此现象出现[7]。这就证明了HNF6在结直肠癌疾病中对肿瘤的生长起效果，并且导致的并发症表现为肝转移，从而最终导致肝衰竭[8]。并且，若是HNF6翻译后缺乏修饰，则会使得蛋白质无法与DNA结合[9]。而Hnf6基因的过表达则可以刺激靶基因Foxa2的表达，靶基因Foxa2在肝脏的发育和分化方面具有非常重要的作用，因此Hnf6基因可以通过调控靶基因Foxa2从而恢复Hnf6的活性而抑制肿瘤生长[10]。此外，Hnf6基因还参与调节葡萄糖水平和胆固醇代谢过程。HNF6身为一种转录激活因子，其肝缺失可以上调众多的脂肪生成基因的表达。这些脂肪生成基因中有许多是生物钟状核受体Reverbα的靶点，当Hnf6在肝脏中缺失时，Reverbα也会丧失在这些位点上的结合能力。因此Hnf6和Reverbα可以协同调节肝脏脂质代谢[11]。所以，进行Hnf6基因的研究对于生物体的脂质代谢和脂肪合成具有重要作用。
本研究采用了原核载体表达技术。大肠杆菌表达系统在众多表达系统中是最早被采用进行研究的表达系统，它也是目前掌握的所有表达系统中研究方法最成熟的表达系统。它所具有的众多优点使之成为了生产重组蛋白的最常用的系统[12]。而本实验使用的原核表达载体pCold III是pCold系列载体中的成员之一，pCold系列载体包括pCold IIV，主要是在大肠杆菌基因中构建插入冷休克基因CspA启动子序列的原核表达系统。它是在冷休克基因CspA启动子设计高效率蛋白质表达载体。并且在CspA的启动子的下游端，插入了lac操纵子，此外，5非翻译区（5ΜTR）、翻译增强元件（TEE）、His标签序列，Xa因子切割位点和多克隆位点（MCS）同样也处于CspA启动子的下游端，以便能够准确控制表达情况。它可以利用大肠杆菌的低温表达基因使大肠杆菌在低温下暂停生长，从而使大部分基因的表达量下降，但冷休克表达载体却可被诱导表达。从而解决了表达蛋白不可溶的问题[13]。pCold III的冷休克特性使它不仅可以在高温下外源基因可以高效表达，而且当低温诱导蛋白表达时，低温抑制了大肠杆菌自身的蛋白质合成，从而使目的蛋白获得较高的表达[14]。并且其在低温中可以被IPTG诱导剂诱导表达，增强了目的蛋白的稳定性表达，且有效促进融合蛋白的可溶性表达，使得蛋白质方便进行高效纯化[15]。
目前对Hnf6基因的研究已有了很大进展，为了探索Hnf6基因在鸡的肝脏的发育和脂质代谢的调控过程，本研究通过基因工程和分子生物学的原理，从鸡肝组织的RT产物中克隆出Hnf6基因，并构建其原核表达载体pCold IIIHnf6，通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达HNF6重组蛋白，为进一步研究HNF6蛋白的结构和功能以及制备抗体提供足够的重组蛋白，为研究其在在鸡的肝脏发育和脂质代谢过程中的作用打下基础。
2 材料与方法
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