耐盐聚磷菌的诱变选育
目 录
1 引言 1
1.1 背景 1
1.2 磷污染与水体富营养化 1
1.3 聚磷菌的聚磷机理 1
1.4 主要的研究内容 2
2 材料与方法 2
2.1 实验材料 2
2.2 主要仪器 2
2.3 实验方法 2
2.4 分析方法 5
2.5 紫外诱变 7
2.6 聚磷菌株的生长曲线及聚磷曲线 8
2.7 聚磷菌株理化性质的研究 9
2.8 菌株鉴定 9
3 结果与分析 10
3.1 高效聚磷菌株的筛选和分离 10
3.2 紫外诱变结果 11
3.3 菌株的生长曲线与聚磷曲线 11
3.4 菌株X-24的理化性质研究 12
3.5 菌株16S rDNA的分析 15
结论 17
致谢 18
参考文献 19
附录A 20
1 引言
1.1 背景
近年来，我国地表水体富营养化现象日益严重，不仅水体生态系统遭到破坏，造成人类生活饮用水的污染，也制约了工农业生产的发展。磷是水体富营养化的限制性因子，因此，去除水体中的磷对于防止水体富营养化尤为重要。聚磷菌是一类特殊的兼性菌，厌氧释磷、好氧状态下能超量吸磷，并将其以聚磷酸盐的形式储存在细胞内，使体内含磷量超过一般细菌含磷量的数倍，是污废水生物除磷的重要菌群。从污水处理厂取出污泥，通过逐步提高废水中的盐度驯化出耐盐微生物，利用微生物方法进行分离、筛选出聚磷菌株，并研究其生物学特性及其除磷特性并测定了菌株适宜生长的盐 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
度范围，以及盐度对除磷的影响，以期为充分发挥聚磷菌的功能，提高废水的除磷脱氮效率创造条件；也为高盐废水除磷的应用推广提供理论依据和技术支持。
1.2 磷污染与水体富营养化
水中的磷是藻类生长需要的一种关键元素，过量磷是造成水体污秽异臭，使湖泊发生富营养化和海湾出现赤潮的主要原因。农药、化肥含有丰富的氮磷，大量未被利用的氮磷养分在土壤中残留并不断的被淋溶到周围环境，特别是水体中，就导致了水体的富营养化。
1.3 聚磷菌的聚磷机理
聚磷菌也叫做摄磷菌，是一类可对磷超量吸收的细菌菌种，磷以聚磷酸盐颗粒(异染粒)的形式存在于细胞内。聚磷菌存在于传统活性污泥工艺中，是一类特殊的兼性细菌，其在好氧或缺氧条件下能超量地将污水中的磷吸入到菌体内，使体内的含磷量比一般细菌体内的含磷量高数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷过程中。
利用聚磷微生物进行污水处理是一项新型的废水处理技术，其机理方面的研究尚处于初级阶段，聚磷菌将污水中大分子的有机物转化成如乙酸等低分子脂肪酸(VFA)，诱导激发菌体分解细胞内的多聚磷酸盐并产生ATP，通过ATP～ADP的转换，将废水中的低链脂肪酸等有机物摄入细胞，以聚-β-羟基丁酸及糖原等有机颗粒的形式储存于细胞内，同时将聚磷酸盐分解成磷酸盐排出细胞外。在好氧环境下，聚磷菌将PHB氧化分解并释放出能量，利用能量主动摄取污水中的磷，合成聚磷酸盐储存于细胞内。
1.4 主要的研究内容
（1）聚磷菌的分离、纯化和筛选：从长期受磷污染的富营养水体中驯化、分离和筛选出高效的聚磷菌菌株。
（2）聚磷菌的鉴定：对筛选得到的聚磷菌做生理生化鉴定及16SrDNA序列测定。
（3）聚磷菌除磷性能的研究：进行聚磷菌生长过程中温度、pH、培养液中NaCl浓度的测定，明确聚磷菌生长能力及除磷能力。
2 材料与方法
2.1 实验材料
实验使用的样品来源于四季春污水处理厂，采样的时间是2014年12月；大肠杆菌，取样来源实验室。
2.2 主要仪器
电热恒温培养箱（DH6000AB），全温培养振荡器（双层）（HZP-250），可见紫外分光光度计（UV-2100），立式压力蒸汽灭菌器，显微镜(XS-212)，PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等。
2.3 实验方法
2.3.1 培养基
表1 耐盐反硝化菌分离培养基
药品名称 取量
CH3COONa 5g/L
K2HPO43H2O 1.3g/L
NaNO2 0.8g/L
NaNO3 1g/L
微量元素液 2mL
人工模拟海水 1L
表2 耐盐反硝化菌基础培养基
药品名称 取量
CH3COONa 9.5g/L
K2HPO43H2O 0.8g/L
KNO3 2.0g/L
微量元素液 2mL
人工模拟海水 1L
表3 耐盐反硝化性能测试培养基
药品名称 取量
NH4Cl 1g/L
CH3COONa 9.5g/L
K2HPO43H2O 1.3g/L
微量元素液 2mL
人工模拟海水 1L
表4 人工模拟海水
药品名称 取量
NaCl 26.726g/L
MgSO4 3.248g/L
MgCl2 2.26g/L
CaCl2 11.53g/L
NaHCO3 0.198 g/L
KCl 0.721g/L
表5 微量元素液
药品名称 取量
EDTA 2.06g/L
FeSO47H2O 1.54g/L
MnCl24H2O 0.2g/L
ZnSO47H2O 0.1g/L
CuSO45H2O 0.02g/L
Na2MnO4 0.1g/L
CoCl26H2O 2mg
以上培养基均于121℃灭菌20min。配制固体分离培养基，按1.5%～2%的琼脂比例加入培养基，pH调7~8，121℃灭菌20min后将50℃左右液体状态的培养基按无菌操作倒入已灭菌的的培养皿内，冷却制成培养基固体平板。
2.3.2 驯化培养
抑制细菌生长的盐浓度于不同细菌间的差别很大，如对大肠杆菌的盐质量浓度是6%，对枯草杆菌却是9%，对嗜盐菌又是10%以上。由淡水环境转变高浓度盐环境时，因为能适应高浓度盐的菌种很少，轮虫、固着及游泳性纤毛虫等原生动物迅速死亡，稳定以后游泳性纤毛虫可以重新出现。从低浓度盐上升到高浓度盐时，微生物要有一个缓慢的适应期，由高浓度盐到低浓度盐的适应期更长，盐浓度的变化可能引起微生物新陈代谢途径的改变。细菌驯化过程就是使细菌代谢方式逐渐地适应高浓度盐环境，并使耐盐菌大量增殖的过程，但这需要一定的时间，急剧地变化盐浓度或驯化时间过短都会使细菌的生长受到抑制，因此把握盐浓度的变化快缓程度和驯化时间是十分重要的。
2.3.3 聚磷菌的筛选与分离
1 引言 1
1.1 背景 1
1.2 磷污染与水体富营养化 1
1.3 聚磷菌的聚磷机理 1
1.4 主要的研究内容 2
2 材料与方法 2
2.1 实验材料 2
2.2 主要仪器 2
2.3 实验方法 2
2.4 分析方法 5
2.5 紫外诱变 7
2.6 聚磷菌株的生长曲线及聚磷曲线 8
2.7 聚磷菌株理化性质的研究 9
2.8 菌株鉴定 9
3 结果与分析 10
3.1 高效聚磷菌株的筛选和分离 10
3.2 紫外诱变结果 11
3.3 菌株的生长曲线与聚磷曲线 11
3.4 菌株X-24的理化性质研究 12
3.5 菌株16S rDNA的分析 15
结论 17
致谢 18
参考文献 19
附录A 20
1 引言
1.1 背景
近年来，我国地表水体富营养化现象日益严重，不仅水体生态系统遭到破坏，造成人类生活饮用水的污染，也制约了工农业生产的发展。磷是水体富营养化的限制性因子，因此，去除水体中的磷对于防止水体富营养化尤为重要。聚磷菌是一类特殊的兼性菌，厌氧释磷、好氧状态下能超量吸磷，并将其以聚磷酸盐的形式储存在细胞内，使体内含磷量超过一般细菌含磷量的数倍，是污废水生物除磷的重要菌群。从污水处理厂取出污泥，通过逐步提高废水中的盐度驯化出耐盐微生物，利用微生物方法进行分离、筛选出聚磷菌株，并研究其生物学特性及其除磷特性并测定了菌株适宜生长的盐 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
度范围，以及盐度对除磷的影响，以期为充分发挥聚磷菌的功能，提高废水的除磷脱氮效率创造条件；也为高盐废水除磷的应用推广提供理论依据和技术支持。
1.2 磷污染与水体富营养化
水中的磷是藻类生长需要的一种关键元素，过量磷是造成水体污秽异臭，使湖泊发生富营养化和海湾出现赤潮的主要原因。农药、化肥含有丰富的氮磷，大量未被利用的氮磷养分在土壤中残留并不断的被淋溶到周围环境，特别是水体中，就导致了水体的富营养化。
1.3 聚磷菌的聚磷机理
聚磷菌也叫做摄磷菌，是一类可对磷超量吸收的细菌菌种，磷以聚磷酸盐颗粒(异染粒)的形式存在于细胞内。聚磷菌存在于传统活性污泥工艺中，是一类特殊的兼性细菌，其在好氧或缺氧条件下能超量地将污水中的磷吸入到菌体内，使体内的含磷量比一般细菌体内的含磷量高数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷过程中。
利用聚磷微生物进行污水处理是一项新型的废水处理技术，其机理方面的研究尚处于初级阶段，聚磷菌将污水中大分子的有机物转化成如乙酸等低分子脂肪酸(VFA)，诱导激发菌体分解细胞内的多聚磷酸盐并产生ATP，通过ATP～ADP的转换，将废水中的低链脂肪酸等有机物摄入细胞，以聚-β-羟基丁酸及糖原等有机颗粒的形式储存于细胞内，同时将聚磷酸盐分解成磷酸盐排出细胞外。在好氧环境下，聚磷菌将PHB氧化分解并释放出能量，利用能量主动摄取污水中的磷，合成聚磷酸盐储存于细胞内。
1.4 主要的研究内容
（1）聚磷菌的分离、纯化和筛选：从长期受磷污染的富营养水体中驯化、分离和筛选出高效的聚磷菌菌株。
（2）聚磷菌的鉴定：对筛选得到的聚磷菌做生理生化鉴定及16SrDNA序列测定。
（3）聚磷菌除磷性能的研究：进行聚磷菌生长过程中温度、pH、培养液中NaCl浓度的测定，明确聚磷菌生长能力及除磷能力。
2 材料与方法
2.1 实验材料
实验使用的样品来源于四季春污水处理厂，采样的时间是2014年12月；大肠杆菌，取样来源实验室。
2.2 主要仪器
电热恒温培养箱（DH6000AB），全温培养振荡器（双层）（HZP-250），可见紫外分光光度计（UV-2100），立式压力蒸汽灭菌器，显微镜(XS-212)，PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等。
2.3 实验方法
2.3.1 培养基
表1 耐盐反硝化菌分离培养基
药品名称 取量
CH3COONa 5g/L
K2HPO43H2O 1.3g/L
NaNO2 0.8g/L
NaNO3 1g/L
微量元素液 2mL
人工模拟海水 1L
表2 耐盐反硝化菌基础培养基
药品名称 取量
CH3COONa 9.5g/L
K2HPO43H2O 0.8g/L
KNO3 2.0g/L
微量元素液 2mL
人工模拟海水 1L
表3 耐盐反硝化性能测试培养基
药品名称 取量
NH4Cl 1g/L
CH3COONa 9.5g/L
K2HPO43H2O 1.3g/L
微量元素液 2mL
人工模拟海水 1L
表4 人工模拟海水
药品名称 取量
NaCl 26.726g/L
MgSO4 3.248g/L
MgCl2 2.26g/L
CaCl2 11.53g/L
NaHCO3 0.198 g/L
KCl 0.721g/L
表5 微量元素液
药品名称 取量
EDTA 2.06g/L
FeSO47H2O 1.54g/L
MnCl24H2O 0.2g/L
ZnSO47H2O 0.1g/L
CuSO45H2O 0.02g/L
Na2MnO4 0.1g/L
CoCl26H2O 2mg
以上培养基均于121℃灭菌20min。配制固体分离培养基，按1.5%～2%的琼脂比例加入培养基，pH调7~8，121℃灭菌20min后将50℃左右液体状态的培养基按无菌操作倒入已灭菌的的培养皿内，冷却制成培养基固体平板。
2.3.2 驯化培养
抑制细菌生长的盐浓度于不同细菌间的差别很大，如对大肠杆菌的盐质量浓度是6%，对枯草杆菌却是9%，对嗜盐菌又是10%以上。由淡水环境转变高浓度盐环境时，因为能适应高浓度盐的菌种很少，轮虫、固着及游泳性纤毛虫等原生动物迅速死亡，稳定以后游泳性纤毛虫可以重新出现。从低浓度盐上升到高浓度盐时，微生物要有一个缓慢的适应期，由高浓度盐到低浓度盐的适应期更长，盐浓度的变化可能引起微生物新陈代谢途径的改变。细菌驯化过程就是使细菌代谢方式逐渐地适应高浓度盐环境，并使耐盐菌大量增殖的过程，但这需要一定的时间，急剧地变化盐浓度或驯化时间过短都会使细菌的生长受到抑制，因此把握盐浓度的变化快缓程度和驯化时间是十分重要的。
2.3.3 聚磷菌的筛选与分离
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