鹅MYL1基因的克隆及表达特征分析
鹅MYL1基因的克隆及表达特征分析[20200408205042]
摘要
肌球蛋白轻链1(Myosin light chain 1，MYL1)基因是肌球蛋白轻链家族成员之一，也属于必需肌球蛋白轻链（Essential myosin light chain，ELC），是编码肌球蛋白所必须的。MYL1基因主要的表达场所是哺乳动物的心室和骨骼肌，但在其他物种的骨骼肌也有表达，因此MYL1基因在肌肉生长发育过程中发挥重要的作用。本研究旨在克隆获得太湖鹅MYL1基因全长cDNA的基础上，进一步探讨该基因的结构，揭示其在鹅胚胎期的表达规律。采用RT-PCR结合RACE的方法，克隆获得MYL1基因全长cDNA序列，并进行生物信息学分析该基因和蛋白的结构特点。通过实时荧光定量PCR技术，检测MYL1基因在鹅不同发育时期的胚胎腿肌组织中表达变化情况。结果表明，鹅的MYL1基因全长cDNA为1542bp，共编码193个氨基酸残基的肽链。预测鹅MYL1蛋白等电点为5.12，分子量为21.75 KD，具有典型的EFh（EF-hand， calcium binding motif）和FRQ1（Ca2+-binding protein，EF-hand superfamily）结构域：EF结构域从130位开始到190位结束，共60个氨基酸；FRQ1结构域从43位开始到193位结束，共150个氨基酸。且不同物种间的EFh氨基酸序列表现为高度同源性。核苷酸序列对比发现，太湖鹅MYL1基因编码区序列与绿头鸭的同源性最高，为98.28%，与斑马鱼、牛、热带爪蟾等物种同源性在65%左右；与原鸡、猪（MLC3f）等物种的同源性较低，仅在55%左右。进一步进行氨基酸序列比对可知：太湖鹅与绿头鸭氨基酸同源性高达100%；与牛、家兔等物种的同源性在65%左右；与猪（MLC3f）、斑马鱼等物种的同源性在59%左右；与原鸡的同源性较低，仅有55%左右。荧光定量PCR结果表示MYL1 基因在鹅胚胎期mRNA表达量总体呈先升高后降低的趋势。该基因在胚胎期E7就有表达，E7以后表达量逐渐升高，在E18表达量达到高峰后逐渐降低。本研究首次提供了鹅肌肉组织主要结构基因MYL1的全序列和蛋白特性，同时又分析其在鹅胚胎生长发育过程中的表达规律，为进一步研究该基因在鹅肌肉发育中的功能奠定基础，也为能提高鹅的肉质达到更高的营养价值和经济效益做贡献。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:太湖鹅MYL1基因克隆基因表达
目 录
1 前言 1
2 材料与方法 3
2.1 试验动物与样品采集 3
2.2 主要试剂及其他材料 3
2.3 主要仪器 3
2.4 引物设计及合成 3
2.5 方法 4
2.5.1 太湖鹅各组织总RNA的提取 4
2.5.2 RT-PCR 扩增 4
2.5.3 PCR反应 5
2.5.4 琼脂糖凝胶DNA回收 6
2.5.5感受态细胞的制备(CaCl2法) 6
2.5.6 目的片段与T载体连接 7
2.5.7连接产物的转化 7
2.5.8质粒提取 7
2.5.9 重组质粒鉴定 8
2.5.10 3’-RACE 8
2.5.11 5’-RACE 9
2.5.12实时荧光定量 PCR 11
2.5.13数据分析 12
3结果与分析 13
3.1 太湖鹅MYL1基因RT-PCR扩增 13
3.2太湖鹅MYL1基因3’-RACE扩增 14
3.3 太湖鹅MYL1基因5’-RACE扩增 14
3.4太湖鹅MYL1基因序列分析 15
3.5 太湖鹅MYL1基因编码蛋白结构的预测 16
3.6 太湖鹅MYL1基因与其他物种的同源性 19
3.7 基于太湖鹅MYL1基因cDNA序列构建系统进化树 20
3.8基于太湖鹅MYL1基因氨基酸序列构建系统进化树 21
3.9 太湖鹅MYL1基因的组织表达分析 22
4 讨论 23
5 结论 24
参考资料 25
致谢 27
1 前 言
当前关于肉质性状的研究中还存在一些问题，如肉质评定标准未统一、调控肉质性状基因的表达规律不细致等，但随着基因技术在育种方法上逐渐发挥作用，其研究成果若应用于生产将产生巨大的经济效益[1]。而基因技术能否在育种方法上发挥作用的前提就是要了解是哪个基因主导着肉质的性状，这样才能将基因技术的优势发挥到最大化。
众所周知，肌肉是肉品质优良的重要决定因素，而肌纤维是肌肉的基本组成物质。一般说来，肌纤维的组织学特性包括肌纤维直径、肌纤维密度、肌纤维、脂肪等。研究表明，肌纤维的组织学特性与肌肉品质特别是食用品质（嫩度、风味、多汁性）性状密切相关，也可以说肌纤维的特征在某种程度上决定了肌肉特性[2]。
肌球蛋白是肌纤维的主要组成之一，可将其分类为两种：非传统肌球蛋白(unconventional myosin)和传统肌球蛋白(conventional myosin)[3]。不论是何种来源的肌球蛋白，均包括4条相对分子质量约为2.2í105的肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MHC)和2条相对分子质量约为1.6×104～2.0×104的肌球蛋白轻链(Myosin light chain，MYL)，两者共同形成一个具有2个球状头部和1个棒状尾部的分子。其中轻链又可分为两种：一对调节轻链和一对必需轻链 [4-6]，前者分别位于头部和杆部与颈部相接连处，后者分别位于2个球状头部[7]。肌球蛋白轻链主要有3种类型:MYL1、MYL2和MYL3。MYL1和MYL3合称为碱性轻链，MYL2称调节轻链。MYL1主要在哺乳动物的心肌、平滑肌和快肌中表达。在哺乳动物中，MYL1 基因有MLC1f、MLC3f两种异构体[8-10]。MLC1f与MLC3f的转录调控受到一系列调控元件的控制，包括两者的启动子元件和MEF2、MEF3等肌肉组织特异增强子元件[9，11-12]。
太湖鹅是我国著名的小型地方鹅种资源，它的优点为肉质优良、产蛋量高、仔鹅生长快等。太湖鹅的消费主要以鹅肉为主，因此鹅肌肉的生长快慢对其产肉性能的优良与养殖效益的多少起决定性作用。因为MYL1 基因在肌肉生长发育过程中发挥了至关重要的作用，而且鹅MYL1 基因至今尚未被克隆和测序。鉴于该基因在肌肉发育过程中的重要意义，本研究采用RT-PCR结合RACE的方法克隆太湖鹅MYL1基因，运用实时荧光定量PCR，检测MYL1基因在太湖鹅胚胎的不同发育时期腿肌组织中的表达情况，为进一步改善肉鹅肌肉质量奠定基础。
2 材料与方法
2.1 试验动物与样品采集
实验所用的鹅胚胎是从常熟市江南畜禽食品公司孵化场采集，E7, E8, E10 , E14, E15, E18, E21, E25和E28的太湖鹅胚胎各4只，液氮速冻后于–80℃保存。
2.2 主要试剂及其他材料
反转录试剂盒、rTaq DNA聚合酶、pMD-18T试剂盒、DNA Marker DL2000、5’-Full RACE Kit和3’-Full RACE Kit、SYBR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)均购自大连TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自QIAGEN公司；感受态细胞E. coli DH5α实验室自制。三羟甲基氨基甲烷(Tris)，氨苄青霉素(Amp)，IPTG，X-gal购自Genview公司；琼脂糖。
2.3主要仪器
DK-8AX型电热恒温水浴锅
梅特勒-托利多电子天平
Biometra梯度PCR仪
5810R型冷冻离心机
2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL移液枪
Biospectrum 410型凝胶成像系统
EPS-300型琼脂糖水平电泳槽
超净工作台
ZQWY-200型恒温摇床培养箱
TG16-WS台式高速离心机
-80℃低温冰箱
隔水式恒温细菌培养箱
2.4 引物设计及合成
根据在NCBI已发表的鸭(登录号：HQ728349)MYL1同源序列分别设计鹅MYL1基因5’RACE 和3’RACE 的特异引物(包括Outer PCR 引物和Inner PCR引物)。同时根据克隆获得的MYL1基因cDNA序列设计荧光定量PCR的引物。引物的相关信息见表2-1。
表2-1 PCR引物的信息
引物名称 Primer name 引物序列(5’-3’) Primer sequence 产物长度/bp 退火温度 Tm(℃) 用途 Purpose
MYL1-PCR F：5- TTCACCCCCGATCAGATTGA -3 370 58 PCR 扩增
R：5- CAACCATTGGCATCTTCCTG -3
MYL1-5’RACE Outer ：5-CAACCATTGGCATCTTCCTG -3 495 58 5’-UTR扩增
Inner：5- CTCATAGGTGCCCGTGTCTT -3
MYL1-3’RACE Outer ：5- TTCACCCCCGATCAGATTGA -3 976 58 3’-UTR扩增
Inner：5- CGTTTTGGCTACTCTGGGTG -3
摘要
肌球蛋白轻链1(Myosin light chain 1，MYL1)基因是肌球蛋白轻链家族成员之一，也属于必需肌球蛋白轻链（Essential myosin light chain，ELC），是编码肌球蛋白所必须的。MYL1基因主要的表达场所是哺乳动物的心室和骨骼肌，但在其他物种的骨骼肌也有表达，因此MYL1基因在肌肉生长发育过程中发挥重要的作用。本研究旨在克隆获得太湖鹅MYL1基因全长cDNA的基础上，进一步探讨该基因的结构，揭示其在鹅胚胎期的表达规律。采用RT-PCR结合RACE的方法，克隆获得MYL1基因全长cDNA序列，并进行生物信息学分析该基因和蛋白的结构特点。通过实时荧光定量PCR技术，检测MYL1基因在鹅不同发育时期的胚胎腿肌组织中表达变化情况。结果表明，鹅的MYL1基因全长cDNA为1542bp，共编码193个氨基酸残基的肽链。预测鹅MYL1蛋白等电点为5.12，分子量为21.75 KD，具有典型的EFh（EF-hand， calcium binding motif）和FRQ1（Ca2+-binding protein，EF-hand superfamily）结构域：EF结构域从130位开始到190位结束，共60个氨基酸；FRQ1结构域从43位开始到193位结束，共150个氨基酸。且不同物种间的EFh氨基酸序列表现为高度同源性。核苷酸序列对比发现，太湖鹅MYL1基因编码区序列与绿头鸭的同源性最高，为98.28%，与斑马鱼、牛、热带爪蟾等物种同源性在65%左右；与原鸡、猪（MLC3f）等物种的同源性较低，仅在55%左右。进一步进行氨基酸序列比对可知：太湖鹅与绿头鸭氨基酸同源性高达100%；与牛、家兔等物种的同源性在65%左右；与猪（MLC3f）、斑马鱼等物种的同源性在59%左右；与原鸡的同源性较低，仅有55%左右。荧光定量PCR结果表示MYL1 基因在鹅胚胎期mRNA表达量总体呈先升高后降低的趋势。该基因在胚胎期E7就有表达，E7以后表达量逐渐升高，在E18表达量达到高峰后逐渐降低。本研究首次提供了鹅肌肉组织主要结构基因MYL1的全序列和蛋白特性，同时又分析其在鹅胚胎生长发育过程中的表达规律，为进一步研究该基因在鹅肌肉发育中的功能奠定基础，也为能提高鹅的肉质达到更高的营养价值和经济效益做贡献。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:太湖鹅MYL1基因克隆基因表达
目 录
1 前言 1
2 材料与方法 3
2.1 试验动物与样品采集 3
2.2 主要试剂及其他材料 3
2.3 主要仪器 3
2.4 引物设计及合成 3
2.5 方法 4
2.5.1 太湖鹅各组织总RNA的提取 4
2.5.2 RT-PCR 扩增 4
2.5.3 PCR反应 5
2.5.4 琼脂糖凝胶DNA回收 6
2.5.5感受态细胞的制备(CaCl2法) 6
2.5.6 目的片段与T载体连接 7
2.5.7连接产物的转化 7
2.5.8质粒提取 7
2.5.9 重组质粒鉴定 8
2.5.10 3’-RACE 8
2.5.11 5’-RACE 9
2.5.12实时荧光定量 PCR 11
2.5.13数据分析 12
3结果与分析 13
3.1 太湖鹅MYL1基因RT-PCR扩增 13
3.2太湖鹅MYL1基因3’-RACE扩增 14
3.3 太湖鹅MYL1基因5’-RACE扩增 14
3.4太湖鹅MYL1基因序列分析 15
3.5 太湖鹅MYL1基因编码蛋白结构的预测 16
3.6 太湖鹅MYL1基因与其他物种的同源性 19
3.7 基于太湖鹅MYL1基因cDNA序列构建系统进化树 20
3.8基于太湖鹅MYL1基因氨基酸序列构建系统进化树 21
3.9 太湖鹅MYL1基因的组织表达分析 22
4 讨论 23
5 结论 24
参考资料 25
致谢 27
1 前 言
当前关于肉质性状的研究中还存在一些问题，如肉质评定标准未统一、调控肉质性状基因的表达规律不细致等，但随着基因技术在育种方法上逐渐发挥作用，其研究成果若应用于生产将产生巨大的经济效益[1]。而基因技术能否在育种方法上发挥作用的前提就是要了解是哪个基因主导着肉质的性状，这样才能将基因技术的优势发挥到最大化。
众所周知，肌肉是肉品质优良的重要决定因素，而肌纤维是肌肉的基本组成物质。一般说来，肌纤维的组织学特性包括肌纤维直径、肌纤维密度、肌纤维、脂肪等。研究表明，肌纤维的组织学特性与肌肉品质特别是食用品质（嫩度、风味、多汁性）性状密切相关，也可以说肌纤维的特征在某种程度上决定了肌肉特性[2]。
肌球蛋白是肌纤维的主要组成之一，可将其分类为两种：非传统肌球蛋白(unconventional myosin)和传统肌球蛋白(conventional myosin)[3]。不论是何种来源的肌球蛋白，均包括4条相对分子质量约为2.2í105的肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MHC)和2条相对分子质量约为1.6×104～2.0×104的肌球蛋白轻链(Myosin light chain，MYL)，两者共同形成一个具有2个球状头部和1个棒状尾部的分子。其中轻链又可分为两种：一对调节轻链和一对必需轻链 [4-6]，前者分别位于头部和杆部与颈部相接连处，后者分别位于2个球状头部[7]。肌球蛋白轻链主要有3种类型:MYL1、MYL2和MYL3。MYL1和MYL3合称为碱性轻链，MYL2称调节轻链。MYL1主要在哺乳动物的心肌、平滑肌和快肌中表达。在哺乳动物中，MYL1 基因有MLC1f、MLC3f两种异构体[8-10]。MLC1f与MLC3f的转录调控受到一系列调控元件的控制，包括两者的启动子元件和MEF2、MEF3等肌肉组织特异增强子元件[9，11-12]。
太湖鹅是我国著名的小型地方鹅种资源，它的优点为肉质优良、产蛋量高、仔鹅生长快等。太湖鹅的消费主要以鹅肉为主，因此鹅肌肉的生长快慢对其产肉性能的优良与养殖效益的多少起决定性作用。因为MYL1 基因在肌肉生长发育过程中发挥了至关重要的作用，而且鹅MYL1 基因至今尚未被克隆和测序。鉴于该基因在肌肉发育过程中的重要意义，本研究采用RT-PCR结合RACE的方法克隆太湖鹅MYL1基因，运用实时荧光定量PCR，检测MYL1基因在太湖鹅胚胎的不同发育时期腿肌组织中的表达情况，为进一步改善肉鹅肌肉质量奠定基础。
2 材料与方法
2.1 试验动物与样品采集
实验所用的鹅胚胎是从常熟市江南畜禽食品公司孵化场采集，E7, E8, E10 , E14, E15, E18, E21, E25和E28的太湖鹅胚胎各4只，液氮速冻后于–80℃保存。
2.2 主要试剂及其他材料
反转录试剂盒、rTaq DNA聚合酶、pMD-18T试剂盒、DNA Marker DL2000、5’-Full RACE Kit和3’-Full RACE Kit、SYBR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)均购自大连TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自QIAGEN公司；感受态细胞E. coli DH5α实验室自制。三羟甲基氨基甲烷(Tris)，氨苄青霉素(Amp)，IPTG，X-gal购自Genview公司；琼脂糖。
2.3主要仪器
DK-8AX型电热恒温水浴锅
梅特勒-托利多电子天平
Biometra梯度PCR仪
5810R型冷冻离心机
2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL移液枪
Biospectrum 410型凝胶成像系统
EPS-300型琼脂糖水平电泳槽
超净工作台
ZQWY-200型恒温摇床培养箱
TG16-WS台式高速离心机
-80℃低温冰箱
隔水式恒温细菌培养箱
2.4 引物设计及合成
根据在NCBI已发表的鸭(登录号：HQ728349)MYL1同源序列分别设计鹅MYL1基因5’RACE 和3’RACE 的特异引物(包括Outer PCR 引物和Inner PCR引物)。同时根据克隆获得的MYL1基因cDNA序列设计荧光定量PCR的引物。引物的相关信息见表2-1。
表2-1 PCR引物的信息
引物名称 Primer name 引物序列(5’-3’) Primer sequence 产物长度/bp 退火温度 Tm(℃) 用途 Purpose
MYL1-PCR F：5- TTCACCCCCGATCAGATTGA -3 370 58 PCR 扩增
R：5- CAACCATTGGCATCTTCCTG -3
MYL1-5’RACE Outer ：5-CAACCATTGGCATCTTCCTG -3 495 58 5’-UTR扩增
Inner：5- CTCATAGGTGCCCGTGTCTT -3
MYL1-3’RACE Outer ：5- TTCACCCCCGATCAGATTGA -3 976 58 3’-UTR扩增
Inner：5- CGTTTTGGCTACTCTGGGTG -3
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