c．bescii双功能纤维素酶基因的克隆表达(附件)
本文根据纤维素酶CelA和ALG的基因序列设计相应引物。并对其进行PCR扩增，将扩增出的目的片段连接到pMD19-T Simple Vector载体，转到JM109于含有Amp抗性的液体LB培养，提取质粒，对质粒进行双酶切，回收所需要的目的基因。将目的基因连接到双酶切过的pPICZαA载体，将含有目的片段的表达载体转入到E.coli JM109、E.coli DH10B以及E.coli DH5α中，挑取阳性转化子，于含zeocin抗性的液体LB中培养，提质粒，用限制性内切酶Sal I单酶切线性化，电击转化进酵母感受态细胞，挑取阳性克隆子于BNGY培养，进行诱导表达。关键词 纤维素酶，克隆，表达
目录
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2 纤维素酶 1
1.3 本课题立题意义与研究内容 3
2 实验用品 4
2.1 主要实验试剂 4
2.2 主要仪器 5
2.3 主要培养基及试剂的配制 6
2.4 琼脂糖凝胶制备 7
2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 7
2.6 酵母感受态的制备 7
3 实验方法 8
3.1 C.bescii纤维素酶CelA基因的克隆 8
3.2 纤维素酶基因ALG的克隆与表达 14
4 结果与讨论 17
4.1 纤维素酶CelA基因的克隆 17
4.2 纤维素酶ALG基因克隆及表达 18
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
绪论
纤维素是最丰富的可再生碳源和我们星球上的能量[1]，是一个线性的葡萄糖单位链[2]通过β1,4糖苷键连接[3]。纤维素酶是可将大纤维素聚合物水解成葡萄糖或纤维寡糖[4]。一般来说，纤维素酶分为三类基团，即内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶（纤维二糖水解酶）和β葡糖苷酶[5]。结晶纤维素构成细胞壁微纤维的核心，这也是高度难以酶水解。Caldicellulosiruptor bescii以前是Anaerocellum thermophilum，属于Firmicute *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
s门和Thermoanaerobacterales III家族是高度嗜热的细菌，其降解和利用结晶纤维素和木聚糖，以及更复杂的底物如未处理的草和硬木，温度为80°C。由于细菌可以同时利用纤维素和蛋白质在高温半纤维素，它被视为一种潜力植物细胞壁解构的生物催化剂来源生物燃料工业。C.bescii基因组的完整测序最近完成了，并对基因组进行了分析，揭示编码9种酶的大型基因簇预测会降解纤维素或半纤维素。当C.bescii在结晶纤维素上生长时，是一个由ORF1954编码的大的多模块酶（CelA），是报道最多能高度分泌的纤维素分解酶。多肽占纤维素基总分泌蛋白的34.7%上清液中纤维素酶的富集。C.bescii CelA的原生形式，由一个组成N端GH9模块和一个C端GH48模块由CBM3c和两个串联连接的CBM3b隔开相同的氨基酸序列，纯化用于生化表征。之前是CBM3c和CBM3b分别命名为C和C。多肽是在本研究中指定CbCel9A/Cel48A来表示第一个GH9和GH48催化模块的生物化学特征来自这个细菌。
研究背景
纤维素占植物干重的35%50%，它是地球上分布最广、含量最为丰富的碳水化合物[6]。对于我们而言，它又是自然界中数量中相当庞大的一笔可再生物质[7]。它的降解是自然界碳素循环中相当重要的一个环节[8]。然而当下我们却只能看着这笔宝贵的财富因没有有效的利用方法而随意的闲弃乃至就地燃烧，不仅是能源的无效利用，更会对大自然环境造成相当大的破坏，加速了全球变暖。因此如何高效的利用纤维素成为了当今时代一个热门的研究方向[4]。
纤维素酶
纤维素酶的分类
C. bescii 具有非常强力的纤维素降解能力，其降解微晶纤维素的能力尤为突出[9]。Caldicellulosiruptor 属中不同种的细菌利用木质纤维素的能力有所差异：在对7种菌的比较中，BlumerSchuette 等[10]发现，C. bescii 降解并利用微晶纤维素Avicel作唯一碳源在其上生长的能力与C. saccharolyticus 相当[11]，远高于其他5种同属细菌。对 C. bescii 的基因组注释发现，该菌降解纤维素相关的酶基因主要集中在一个多糖降解的基因簇上，该基因组所编码的催化蛋白大多是双功能纤维素酶，如：木聚糖酶、甘露聚糖酶和木葡聚糖酶等[12]。对8个 Caldicellulosiruptor 属细菌的基因组学分析发现存在3个核心的多结构域酶，分别为 GH9CBM3cCBM3bCBM3bGH48（CelA或CbCel9A/Cel48A）、 GH74CBM3b CBM3b GH48 和 GH9CBM3bCBM3bCBM3b GH5（CbCel9B/Man5A）；说明这3个酶存在与否与该属细菌降解纤维素的能力成正相关[13]。在C. bescii 中，这3个其主要功能的酶以完整的结构域形态存在，而在其他菌种，这3种酶可能以完整的形态存在，也可能以残缺不完整的形态存在。
纤维素的分解机制
在C. bescii中，GH9CBM3cCBM3bCBM3bGH48被称为CelA[14]或 CbCel9A /Cel48A[15]。GH9 和 GH48分别为内切和外切纤维素酶，能协同降解纤维素[16]。受限于酶的自身特性，它不管以外切还是内切的方式，纤维素酶切割过一定链长的纤维素后都会从纤维素上脱落，由于GH9、GH48和中间的3个CBMs均具有结合纤维素的能力，这使得解离的催化结构域又能很快找到纤维素底物。CelA具有高效降解微晶纤维素的能力正是由于这种内协同效应和较强的底物结合能力。很显然，CelA这种独特的结构域组织形式与其高效降解底物的能力是密不可分的；而这种结构域组织形式被认为可能反映了自然界继自由酶和纤维小体后的第三种降解纤维素的方式，是一种处于自由酶和纤维小体之间、过渡态的降解形式[17]。除了CelA，C. bescii还编码了5个这种类型的多结构域双功能催化纤维素酶，在多肽链的N端和C端分别是不同家族的糖苷水解酶，间隔以23个碳水化合物结合结构域[17]。除CelA为纤维素酶外，其余5个酶均为双功能酶，它们分别针对植物细胞壁不同的组分。由于植物细胞壁多糖未经预处理时，会在物理上紧密相连，考虑到CelA 对微晶纤维素的强大降解能力，这种特殊的结构域组织形式是否对这类酶降解完整植物细胞壁也有类似的促进作用，值得实验研究的进一步证明。
目录
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2 纤维素酶 1
1.3 本课题立题意义与研究内容 3
2 实验用品 4
2.1 主要实验试剂 4
2.2 主要仪器 5
2.3 主要培养基及试剂的配制 6
2.4 琼脂糖凝胶制备 7
2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 7
2.6 酵母感受态的制备 7
3 实验方法 8
3.1 C.bescii纤维素酶CelA基因的克隆 8
3.2 纤维素酶基因ALG的克隆与表达 14
4 结果与讨论 17
4.1 纤维素酶CelA基因的克隆 17
4.2 纤维素酶ALG基因克隆及表达 18
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
绪论
纤维素是最丰富的可再生碳源和我们星球上的能量[1]，是一个线性的葡萄糖单位链[2]通过β1,4糖苷键连接[3]。纤维素酶是可将大纤维素聚合物水解成葡萄糖或纤维寡糖[4]。一般来说，纤维素酶分为三类基团，即内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶（纤维二糖水解酶）和β葡糖苷酶[5]。结晶纤维素构成细胞壁微纤维的核心，这也是高度难以酶水解。Caldicellulosiruptor bescii以前是Anaerocellum thermophilum，属于Firmicute *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
s门和Thermoanaerobacterales III家族是高度嗜热的细菌，其降解和利用结晶纤维素和木聚糖，以及更复杂的底物如未处理的草和硬木，温度为80°C。由于细菌可以同时利用纤维素和蛋白质在高温半纤维素，它被视为一种潜力植物细胞壁解构的生物催化剂来源生物燃料工业。C.bescii基因组的完整测序最近完成了，并对基因组进行了分析，揭示编码9种酶的大型基因簇预测会降解纤维素或半纤维素。当C.bescii在结晶纤维素上生长时，是一个由ORF1954编码的大的多模块酶（CelA），是报道最多能高度分泌的纤维素分解酶。多肽占纤维素基总分泌蛋白的34.7%上清液中纤维素酶的富集。C.bescii CelA的原生形式，由一个组成N端GH9模块和一个C端GH48模块由CBM3c和两个串联连接的CBM3b隔开相同的氨基酸序列，纯化用于生化表征。之前是CBM3c和CBM3b分别命名为C和C。多肽是在本研究中指定CbCel9A/Cel48A来表示第一个GH9和GH48催化模块的生物化学特征来自这个细菌。
研究背景
纤维素占植物干重的35%50%，它是地球上分布最广、含量最为丰富的碳水化合物[6]。对于我们而言，它又是自然界中数量中相当庞大的一笔可再生物质[7]。它的降解是自然界碳素循环中相当重要的一个环节[8]。然而当下我们却只能看着这笔宝贵的财富因没有有效的利用方法而随意的闲弃乃至就地燃烧，不仅是能源的无效利用，更会对大自然环境造成相当大的破坏，加速了全球变暖。因此如何高效的利用纤维素成为了当今时代一个热门的研究方向[4]。
纤维素酶
纤维素酶的分类
C. bescii 具有非常强力的纤维素降解能力，其降解微晶纤维素的能力尤为突出[9]。Caldicellulosiruptor 属中不同种的细菌利用木质纤维素的能力有所差异：在对7种菌的比较中，BlumerSchuette 等[10]发现，C. bescii 降解并利用微晶纤维素Avicel作唯一碳源在其上生长的能力与C. saccharolyticus 相当[11]，远高于其他5种同属细菌。对 C. bescii 的基因组注释发现，该菌降解纤维素相关的酶基因主要集中在一个多糖降解的基因簇上，该基因组所编码的催化蛋白大多是双功能纤维素酶，如：木聚糖酶、甘露聚糖酶和木葡聚糖酶等[12]。对8个 Caldicellulosiruptor 属细菌的基因组学分析发现存在3个核心的多结构域酶，分别为 GH9CBM3cCBM3bCBM3bGH48（CelA或CbCel9A/Cel48A）、 GH74CBM3b CBM3b GH48 和 GH9CBM3bCBM3bCBM3b GH5（CbCel9B/Man5A）；说明这3个酶存在与否与该属细菌降解纤维素的能力成正相关[13]。在C. bescii 中，这3个其主要功能的酶以完整的结构域形态存在，而在其他菌种，这3种酶可能以完整的形态存在，也可能以残缺不完整的形态存在。
纤维素的分解机制
在C. bescii中，GH9CBM3cCBM3bCBM3bGH48被称为CelA[14]或 CbCel9A /Cel48A[15]。GH9 和 GH48分别为内切和外切纤维素酶，能协同降解纤维素[16]。受限于酶的自身特性，它不管以外切还是内切的方式，纤维素酶切割过一定链长的纤维素后都会从纤维素上脱落，由于GH9、GH48和中间的3个CBMs均具有结合纤维素的能力，这使得解离的催化结构域又能很快找到纤维素底物。CelA具有高效降解微晶纤维素的能力正是由于这种内协同效应和较强的底物结合能力。很显然，CelA这种独特的结构域组织形式与其高效降解底物的能力是密不可分的；而这种结构域组织形式被认为可能反映了自然界继自由酶和纤维小体后的第三种降解纤维素的方式，是一种处于自由酶和纤维小体之间、过渡态的降解形式[17]。除了CelA，C. bescii还编码了5个这种类型的多结构域双功能催化纤维素酶，在多肽链的N端和C端分别是不同家族的糖苷水解酶，间隔以23个碳水化合物结合结构域[17]。除CelA为纤维素酶外，其余5个酶均为双功能酶，它们分别针对植物细胞壁不同的组分。由于植物细胞壁多糖未经预处理时，会在物理上紧密相连，考虑到CelA 对微晶纤维素的强大降解能力，这种特殊的结构域组织形式是否对这类酶降解完整植物细胞壁也有类似的促进作用，值得实验研究的进一步证明。
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