超声对酶促核苷酯衍生物合成的选择性影响
目 录
1 引言 1
1.1 核苷修饰方法 1
1.2 脂肪酶 2
1.3 影响酶催化的因素 2
1.4 超声波对酶促反应的影响 3
1.5 研究内容与意义 4
2 材料与方法 4
2.1 试剂和原料 4
2.1.1 酶 4
2.1.2 主要试剂 5
2.2 仪器设备 5
2.3 实验方法 5
2.3.2 脱水有机溶剂的制备 5
2.3.3 有机溶剂对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.4 超声时间对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.5 超声频率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.6 超声温度对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.7 超声功率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.4 产物分离纯化与结构鉴定 7
2.4.1 反应初速度、底物转化率、区域选择性的计算 7
2.4.2 高效液相色谱（HPLC）分析 7
2.4.3 2′-甲氧基尿苷与癸酸乙烯酯的分离纯化与表征 8
3 结果与分析 8
3.1 有机溶剂对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 8
3.2 超声时间对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 9
3.3 超声频率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 10
3.4 超声温度对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
3.5 超声功率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 12
结 论 13
致 谢 14
参考文献 15
附录 16
1 引言
核苷是核酸的主要构成组分，是一种非常重要的生物大分子。某些核苷类化合物及其衍生物可以在生物体中发挥非常重要的生理功能，甚至可以作为药物用于泌尿、中枢神经以及心血管等疾病的治疗。如黄嘌呤核苷具有增加白血球的能力，对于治疗肝炎、风湿性心脏病等都具有良好的疗效[1]。由于核苷类产品的使用具有极强的专业性，其不仅成为制备生物医学药品的基本元素，而且成为现代生物医学研究领域不可或缺的原料。因此，核苷在DNA芯片、现代分子生物学记忆基因克隆等方面都有着非常广泛的应用范围和极其重要的应用价值。
现阶段核苷的合成方式主要有3种，即RNA酶解法、化学合成法和酶法生物合成法。虽然目前工业上通常用选RNA酶解法来制备核苷，但是这种方法在实际操作中如下一些缺点，如产物的分离步骤多、提取困难、产品的纯度低。化学合成法的途径很多，但缺点是原料不易得，形成的糖苷键缺乏立体专一性，所用试剂昂贵并带有一定毒性，产品收率也很低。酶法生物合成是通过微生物酶或细胞来合成核苷，解决了产物的分离纯化困难的难题，以及细胞通透性的等问题。此外，酶法生物合成法还具有其它多重优点，在核苷合成领域有极大的应用价值。
1.1 核苷修饰方法
核苷衍生物是核酸的抗代谢物，能够选择性的抑制病毒的合成。其在病毒复制过程中通过取代病毒正常的核酸前体，或抑制核酸合成酶的方式，来阻断病毒遗传物质的合成，因此。核苷衍生物可通过对核苷的组成部分即碱基和核糖的改造来获得，其改造形式可分为两种，既可以同时对核苷的碱基和糖基进行双重改造，也可以仅对核苷的碱基或糖基进行部分改造[2]。
修饰核苷按其化学结构可以分为三种类型[3]。（1）简单修饰性核苷：这类修饰核苷与普通核苷的差异可能在碱基上或者是糖苷键上。（2）中度修饰性核苷：这类修饰核苷的修饰集团较小，甲基、甲氧基、和乙酰基等都可作为其修饰集团。形成如1-甲基腺苷，3-甲基胞苷，5-甲氧基腺，N4-乙酰基胞苷等。另外，胸腺嘧啶碱基一般出现在DNA中，形成脱氧胸腺（T），但是由于tRNA中有核糖胸苷，故缩写成rT，以便与T区别。（3） 高度修饰性核苷：这类核苷碱基修饰数量较多，它的修饰方法是将一个比较复杂的化学基团加到核苷碱基上，如将修饰基团分别添加到碱基的两个位置上， 如2-甲硫基-N6-?2-异戊烯腺苷等。
1.2 脂肪酶
脂肪酶在人体，微生物以及动植物中遍布广泛。它除了具有一般酶的特性外，还能够在异相体系中依然保持较好的生物活性，即能在油水界面催化酯合成反应[4]。在脂肪酶的表面有一个特定的空间结构，它就是脂肪酶的活性中心。酶的活性中心是酶发挥催化功能息息相关的一个特定区域，这个部位可与底物结合以使酶发挥催化作用。如果破坏了酶蛋白的整体结构必然会破坏酶活性中心，而酶活性中心空间结构的破坏必然会使酶失去催化活性[5]。此外，酶蛋白活性中心以外的其它部分对于酶发挥催化作用也必不可少，这些部分能保护酶蛋白分子周围的微环境以及维持酶结构的完整。
研究表明，不同脂肪酶催化中心的结构有很大程度上的相同，其结构组成与丝氨酸的催化三元组十分相似。这主要是由于生物体之间的同源性以及生物体在进化过程中的保守性使得不同的氨基酸在组成不同的脂肪酶时依然能够保持催化中心的结构相似。但同时，研究人员还发现，来源不同的脂肪酶其催化机制一般不同。一般情况下，脂肪酶在疏水相中，它有一个由ɑ-螺旋结构构成的“盖子”结构，一旦这个结构被打开，其就能表现出界面活性。与大多数脂肪酶不同的是南极洲假丝酵母脂肪酶B（CALB）没有这个盖子，因此，CALB无界面活性[6, 7]。脂肪酶有一个由几个氢键供体所构成的活性口袋，这个活性口袋被称为“氧负离子空洞”，它是确定脂肪酶立体选择性的关键，口袋空间的大小可以用来衡量脂肪酶的选择性。
1.3 影响酶催化的因素
（1）含水量对酶活性的影响
酶所处的环境中是否有水的存在对于酶能否发挥催化作用是至关重要的。酶蛋白分子之所以可以表现出一定的柔性和刚性，是因为它可以与水分子形成分子间氢键以及在水溶液中形成分子内氢键。若反应过程中缺少水，酶蛋白将会因为分子构象的改变而丧失其催化活性。然而实验发现，酶活性的大小与溶液中溶剂的含水量没有关系，而是与酶表面吸附的水分的量密切相关，而且通常把包裹在酶分子表面的吸附层水量称为必需水，它们的存在对于维持酶的活性是必不可少的。因此可以用一种含有微量水的有机介质体系进行酶催化反应，这种体系的含水量一般小于2%，被称为非水体系。大量实验表明，酶表面的含水量既有上限也有下线，若是低于必需水的含量则会破坏酶分子的构象而使酶的催化活性丧失。但是，如果酶表面的水量过多时，酶的活性也会因此降低，将酶因水份过多而失活的含水量定为上限，可用这个上限作为参考来控制溶液的pH等。
图 1.1 实验路线
2 材料与方法
2.1 试剂和原料
2.1.1 酶
Thermomyces lanuginosus脂肪酶（Lipozyme TLIM，固定化于大孔阴离子树脂， 50 U/mg），购自Novozymes公司。
在6个10 mL螺口带盖玻璃瓶中分别加入2 mL的脱水丙酮试剂、0.02 mmol 2′-甲氧基尿苷、0.2 mmol癸酸乙烯酯和100 mg Lipozym TLIM，混合均匀，实验时分别将超声波清洗器的功率调为80、120、140、160、180、200 W进行反应，反应温度设为45 ℃，频率80 kHz。反应定时取样20 μL，用甲醇-纯水（80/20）稀释样品50倍，离心（10000 r/min，离心10 min），取上清液，供高效液相色谱分析。
1 引言 1
1.1 核苷修饰方法 1
1.2 脂肪酶 2
1.3 影响酶催化的因素 2
1.4 超声波对酶促反应的影响 3
1.5 研究内容与意义 4
2 材料与方法 4
2.1 试剂和原料 4
2.1.1 酶 4
2.1.2 主要试剂 5
2.2 仪器设备 5
2.3 实验方法 5
2.3.2 脱水有机溶剂的制备 5
2.3.3 有机溶剂对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.4 超声时间对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.5 超声频率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.6 超声温度对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.3.7 超声功率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 6
2.4 产物分离纯化与结构鉴定 7
2.4.1 反应初速度、底物转化率、区域选择性的计算 7
2.4.2 高效液相色谱（HPLC）分析 7
2.4.3 2′-甲氧基尿苷与癸酸乙烯酯的分离纯化与表征 8
3 结果与分析 8
3.1 有机溶剂对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 8
3.2 超声时间对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 9
3.3 超声频率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 10
3.4 超声温度对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
3.5 超声功率对脂肪酶催化2′-甲氧基尿苷酰化反应的影响 12
结 论 13
致 谢 14
参考文献 15
附录 16
1 引言
核苷是核酸的主要构成组分，是一种非常重要的生物大分子。某些核苷类化合物及其衍生物可以在生物体中发挥非常重要的生理功能，甚至可以作为药物用于泌尿、中枢神经以及心血管等疾病的治疗。如黄嘌呤核苷具有增加白血球的能力，对于治疗肝炎、风湿性心脏病等都具有良好的疗效[1]。由于核苷类产品的使用具有极强的专业性，其不仅成为制备生物医学药品的基本元素，而且成为现代生物医学研究领域不可或缺的原料。因此，核苷在DNA芯片、现代分子生物学记忆基因克隆等方面都有着非常广泛的应用范围和极其重要的应用价值。
现阶段核苷的合成方式主要有3种，即RNA酶解法、化学合成法和酶法生物合成法。虽然目前工业上通常用选RNA酶解法来制备核苷，但是这种方法在实际操作中如下一些缺点，如产物的分离步骤多、提取困难、产品的纯度低。化学合成法的途径很多，但缺点是原料不易得，形成的糖苷键缺乏立体专一性，所用试剂昂贵并带有一定毒性，产品收率也很低。酶法生物合成是通过微生物酶或细胞来合成核苷，解决了产物的分离纯化困难的难题，以及细胞通透性的等问题。此外，酶法生物合成法还具有其它多重优点，在核苷合成领域有极大的应用价值。
1.1 核苷修饰方法
核苷衍生物是核酸的抗代谢物，能够选择性的抑制病毒的合成。其在病毒复制过程中通过取代病毒正常的核酸前体，或抑制核酸合成酶的方式，来阻断病毒遗传物质的合成，因此。核苷衍生物可通过对核苷的组成部分即碱基和核糖的改造来获得，其改造形式可分为两种，既可以同时对核苷的碱基和糖基进行双重改造，也可以仅对核苷的碱基或糖基进行部分改造[2]。
修饰核苷按其化学结构可以分为三种类型[3]。（1）简单修饰性核苷：这类修饰核苷与普通核苷的差异可能在碱基上或者是糖苷键上。（2）中度修饰性核苷：这类修饰核苷的修饰集团较小，甲基、甲氧基、和乙酰基等都可作为其修饰集团。形成如1-甲基腺苷，3-甲基胞苷，5-甲氧基腺，N4-乙酰基胞苷等。另外，胸腺嘧啶碱基一般出现在DNA中，形成脱氧胸腺（T），但是由于tRNA中有核糖胸苷，故缩写成rT，以便与T区别。（3） 高度修饰性核苷：这类核苷碱基修饰数量较多，它的修饰方法是将一个比较复杂的化学基团加到核苷碱基上，如将修饰基团分别添加到碱基的两个位置上， 如2-甲硫基-N6-?2-异戊烯腺苷等。
1.2 脂肪酶
脂肪酶在人体，微生物以及动植物中遍布广泛。它除了具有一般酶的特性外，还能够在异相体系中依然保持较好的生物活性，即能在油水界面催化酯合成反应[4]。在脂肪酶的表面有一个特定的空间结构，它就是脂肪酶的活性中心。酶的活性中心是酶发挥催化功能息息相关的一个特定区域，这个部位可与底物结合以使酶发挥催化作用。如果破坏了酶蛋白的整体结构必然会破坏酶活性中心，而酶活性中心空间结构的破坏必然会使酶失去催化活性[5]。此外，酶蛋白活性中心以外的其它部分对于酶发挥催化作用也必不可少，这些部分能保护酶蛋白分子周围的微环境以及维持酶结构的完整。
研究表明，不同脂肪酶催化中心的结构有很大程度上的相同，其结构组成与丝氨酸的催化三元组十分相似。这主要是由于生物体之间的同源性以及生物体在进化过程中的保守性使得不同的氨基酸在组成不同的脂肪酶时依然能够保持催化中心的结构相似。但同时，研究人员还发现，来源不同的脂肪酶其催化机制一般不同。一般情况下，脂肪酶在疏水相中，它有一个由ɑ-螺旋结构构成的“盖子”结构，一旦这个结构被打开，其就能表现出界面活性。与大多数脂肪酶不同的是南极洲假丝酵母脂肪酶B（CALB）没有这个盖子，因此，CALB无界面活性[6, 7]。脂肪酶有一个由几个氢键供体所构成的活性口袋，这个活性口袋被称为“氧负离子空洞”，它是确定脂肪酶立体选择性的关键，口袋空间的大小可以用来衡量脂肪酶的选择性。
1.3 影响酶催化的因素
（1）含水量对酶活性的影响
酶所处的环境中是否有水的存在对于酶能否发挥催化作用是至关重要的。酶蛋白分子之所以可以表现出一定的柔性和刚性，是因为它可以与水分子形成分子间氢键以及在水溶液中形成分子内氢键。若反应过程中缺少水，酶蛋白将会因为分子构象的改变而丧失其催化活性。然而实验发现，酶活性的大小与溶液中溶剂的含水量没有关系，而是与酶表面吸附的水分的量密切相关，而且通常把包裹在酶分子表面的吸附层水量称为必需水，它们的存在对于维持酶的活性是必不可少的。因此可以用一种含有微量水的有机介质体系进行酶催化反应，这种体系的含水量一般小于2%，被称为非水体系。大量实验表明，酶表面的含水量既有上限也有下线，若是低于必需水的含量则会破坏酶分子的构象而使酶的催化活性丧失。但是，如果酶表面的水量过多时，酶的活性也会因此降低，将酶因水份过多而失活的含水量定为上限，可用这个上限作为参考来控制溶液的pH等。
图 1.1 实验路线
2 材料与方法
2.1 试剂和原料
2.1.1 酶
Thermomyces lanuginosus脂肪酶（Lipozyme TLIM，固定化于大孔阴离子树脂， 50 U/mg），购自Novozymes公司。
在6个10 mL螺口带盖玻璃瓶中分别加入2 mL的脱水丙酮试剂、0.02 mmol 2′-甲氧基尿苷、0.2 mmol癸酸乙烯酯和100 mg Lipozym TLIM，混合均匀，实验时分别将超声波清洗器的功率调为80、120、140、160、180、200 W进行反应，反应温度设为45 ℃，频率80 kHz。反应定时取样20 μL，用甲醇-纯水（80/20）稀释样品50倍，离心（10000 r/min，离心10 min），取上清液，供高效液相色谱分析。
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