反硝化聚磷菌聚磷特性的研究
目 录
1引言 1
1.1 反硝化聚磷菌简介 1
1.2 反硝化聚磷菌作用机理 1
1.3 反硝化除磷的影响因素 2
1.3.1 碳源的影响 2
1.3.2 起始pH的影响 2
1.3.3 温度的影响 2
1.3.4 接种量的影响 2
1.3.5 转速的影响 2
1.4 课题的研究内容 2
1.4.1 菌株生理生化鉴定 2
1.4.1.1 生理试验 2
1.4.1.2 生化试验 3
1.4.2 PHB和异染颗粒poly-P染色实验 3
1.4.3菌株培养条件优化 3
1.4.4 生长曲线绘制 3
1.4.5聚磷效果测定 3
1.5 课题研究的意义 3
2 实验材料和方法 4
2.1 实验材料及仪器 4
2.1.1 实验材料 4
2.1.2 实验试剂 4
2.1.2.1 生理生化实验所用试剂 4
2.1.2.2 PHB和异染颗粒poly-P双染实验所用试剂 4
2.1.2.3 钼锑抗分光光度法所用试剂 4
2.1.3 实验仪器 5
2.2 实验方法 5
2.2.1 菌株的生理生化鉴定 5
2.2.2 种子液制备 5
2.2.3 PHB和异染颗粒poly-P染色实验 6
2.2.3.1 样品稀释液的制备 6
2.2.3.2 平板涂布 6
2.2.3.3 染色实验 6
2.2.4 钼锑抗分光光度法 6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
/> 2.2.4.1 原理 6
2.2.4.2 步骤 6
2.4.4.3绘制标准曲线 7
2.2.5 优化方案及步骤 7
2.2.5.1 准备 7
2.2.5.2 优化 7
2.2.6绘制生长曲线的步骤及方法 8
2.2.7 聚磷效果测定的方法及步骤 8
2.2.7.1 准备 8
2.2.7.2 离心 9
3 结果分析 9
3.1 生理实验结果分析 9
3.2生化实验结果分析 9
3.3 类脂粒PHB和异染颗粒poly-P染色实验结果 10
3.4 培养条件优化结果 11
3.4.1 校准曲线绘制 11
3,4.2 优化结果分析 11
3.4.2.1 温度优化结果 11
3.4.2.2 碳源优化结果 12
3.4.2.3 pH优化结果 13
3.4.2.4 转速优化结果 14
3.4.2.5 接种量优化结果 15
3.5 生长曲线绘制结果 16
3.5.1 OD600nm值测量 16
3.6 聚磷效果测定结果 17
3.6.1 标准曲线的绘制 17
3.6.2 总磷含量测定结果 18
3.6.3 离心后菌体干重m值测量结果 18
3.6.4 B组OD700nm值测量 18
3.6.5 A组OD700nm值测量 19
结 论 21
致 谢 22
参考文献 23
1引言
一般说来，聚磷菌分为两种，好氧聚磷菌和兼性厌氧型反硝化聚磷菌，两者中好氧聚磷菌只能利用氧作为电子受体，但是反硝化聚磷菌可以使用硝酸盐作为电子受体。近年来，反硝化除磷技术以其独特的优势而成为废水生物处理技术领域的研究热门。
1.1 反硝化聚磷菌简介
反硝化聚磷菌（Denitrifying Phosphorus Accumulating Organisms，DPAOs）同时具有反硝化脱氮和除磷的功能，在节约能耗、减少污泥产生量的同时，还解决了传统的脱氮除磷过程中的聚磷菌和反硝化菌碳源竞争的矛盾以及聚磷菌和硝化菌泥龄差异的矛盾[1]。近年来，研究学者们发现了一种“兼性厌氧反硝化除磷细菌”(DPB)，可以在缺氧条件下，使用硝酸盐作为电子受体氧化胞内贮存的聚羟基脂肪酸酯，并从环境中摄磷、实现同时反硝化和过度摄磷，和传统的好氧吸磷对比，在保证硝化效果的同时减少了系统的消耗,一方面为解决处理含高氮磷工业废水而存在得碳源不足的问题提供了一条实际应用的途径,另一方面剩余的COD也可用于产生甲烷[2]。
1.2 反硝化聚磷菌作用机理
反硝化聚磷菌可以在厌氧状态下，聚磷菌通过糖酵解和水解释放贮存在菌体内部的磷酸盐直接获得能量，形成的能量直接储存于细胞中。得到的能量一部分被用来维持聚磷菌的生存需要，另外一部分则用于聚磷菌合成PHB。而在好氧阶段则可以利用硝酸盐作为电子受体，在将硝酸盐还原成氮气的同时进行超量吸磷作用，从而达到脱氮和除磷的目的[3]。下图为其生物除磷代谢模型。
图1 生物除磷代谢模型
1.3 反硝化除磷的影响因素
生物除磷工艺是目前最经济有效且被广泛认可的一种工艺，该工艺可以在厌氧段和好氧段交错运行，达到富集聚磷菌的目的。但即便在有利于生物除磷系统运行的条件下，同样还是会发生系统除磷效果变得很差甚至毫无结果[4]。目前，主要的影响因素研究有以下几个方面。
1.3.1 碳源的影响
目前，实验室规模的生物除磷系统大都采用乙酸作为唯一碳源进行研究，大多数系统都具有良好稳定的除磷效果。但是近年研究者发现，丙酸作为碳源在长期除磷效果上要优于乙酸。进一步又有人发现采用乙酸和丙酸混合碳源可获得更好的除磷效果，聚磷菌可能占据更大的竞争优势[4]。
葡萄糖是除乙酸之外最被广泛采用的碳源，但是仍存在争议。
1.3.2 起始pH的影响
pH高低影响到菌体生长情况，厌氧段的菌体糖酵解能力改变和好氧阶段的菌体摄磷能力改变对菌株聚磷率和摄磷率的影响很大。
1.3.3 温度的影响
早期报道中，低温环境要比高温环境的除磷效果更佳，但是低温环境时其反应速率会下降。
1.3.4 接种量的影响
接种量的差别直接影响到OD值，但OD值不分死菌活菌，所以对于菌体聚磷率有很大影响。
1.3.5 转速的影响
转速快慢直接影响到菌体生长情况，厌氧段的菌体糖酵解能力改变和好氧阶段的菌体摄磷能力改变对菌株聚磷率和摄磷率的影响很大。
1.4 课题的研究内容
1.4.1 菌株生理生化鉴定
1.4.1.1 生理试验
将两株反硝化聚磷菌株MA-5和X-24稀释涂布培养后，观察其菌落、菌体、褶皱、湿润、凸起、颜色和运动形态。
1.4.1.2 生化试验
2.1 实验材料及仪器
2.1.1 实验材料
菌种：MA-5，X-24。
培养基：⑴ PLB培养基：蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 2%-3%、KH2PO4 25-75-100 mg/L；⑵ 聚磷培养基：MgSO4 82 mg/L、CaCl2 60 mg/L、(NH4)2SO4 0.2 g/L、酵母粉 2 g/L、K2HPO4 50 mg/L、pH 7.0-7.4。（碳源优化时加入相应分子质量的碳源）⑶ 富磷固体培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨6 g/L、KH2PO4 0.02 g/L、琼脂20 g/L、pH 7.2左右。
1引言 1
1.1 反硝化聚磷菌简介 1
1.2 反硝化聚磷菌作用机理 1
1.3 反硝化除磷的影响因素 2
1.3.1 碳源的影响 2
1.3.2 起始pH的影响 2
1.3.3 温度的影响 2
1.3.4 接种量的影响 2
1.3.5 转速的影响 2
1.4 课题的研究内容 2
1.4.1 菌株生理生化鉴定 2
1.4.1.1 生理试验 2
1.4.1.2 生化试验 3
1.4.2 PHB和异染颗粒poly-P染色实验 3
1.4.3菌株培养条件优化 3
1.4.4 生长曲线绘制 3
1.4.5聚磷效果测定 3
1.5 课题研究的意义 3
2 实验材料和方法 4
2.1 实验材料及仪器 4
2.1.1 实验材料 4
2.1.2 实验试剂 4
2.1.2.1 生理生化实验所用试剂 4
2.1.2.2 PHB和异染颗粒poly-P双染实验所用试剂 4
2.1.2.3 钼锑抗分光光度法所用试剂 4
2.1.3 实验仪器 5
2.2 实验方法 5
2.2.1 菌株的生理生化鉴定 5
2.2.2 种子液制备 5
2.2.3 PHB和异染颗粒poly-P染色实验 6
2.2.3.1 样品稀释液的制备 6
2.2.3.2 平板涂布 6
2.2.3.3 染色实验 6
2.2.4 钼锑抗分光光度法 6
/> 2.2.4.1 原理 6
2.2.4.2 步骤 6
2.4.4.3绘制标准曲线 7
2.2.5 优化方案及步骤 7
2.2.5.1 准备 7
2.2.5.2 优化 7
2.2.6绘制生长曲线的步骤及方法 8
2.2.7 聚磷效果测定的方法及步骤 8
2.2.7.1 准备 8
2.2.7.2 离心 9
3 结果分析 9
3.1 生理实验结果分析 9
3.2生化实验结果分析 9
3.3 类脂粒PHB和异染颗粒poly-P染色实验结果 10
3.4 培养条件优化结果 11
3.4.1 校准曲线绘制 11
3,4.2 优化结果分析 11
3.4.2.1 温度优化结果 11
3.4.2.2 碳源优化结果 12
3.4.2.3 pH优化结果 13
3.4.2.4 转速优化结果 14
3.4.2.5 接种量优化结果 15
3.5 生长曲线绘制结果 16
3.5.1 OD600nm值测量 16
3.6 聚磷效果测定结果 17
3.6.1 标准曲线的绘制 17
3.6.2 总磷含量测定结果 18
3.6.3 离心后菌体干重m值测量结果 18
3.6.4 B组OD700nm值测量 18
3.6.5 A组OD700nm值测量 19
结 论 21
致 谢 22
参考文献 23
1引言
一般说来，聚磷菌分为两种，好氧聚磷菌和兼性厌氧型反硝化聚磷菌，两者中好氧聚磷菌只能利用氧作为电子受体，但是反硝化聚磷菌可以使用硝酸盐作为电子受体。近年来，反硝化除磷技术以其独特的优势而成为废水生物处理技术领域的研究热门。
1.1 反硝化聚磷菌简介
反硝化聚磷菌（Denitrifying Phosphorus Accumulating Organisms，DPAOs）同时具有反硝化脱氮和除磷的功能，在节约能耗、减少污泥产生量的同时，还解决了传统的脱氮除磷过程中的聚磷菌和反硝化菌碳源竞争的矛盾以及聚磷菌和硝化菌泥龄差异的矛盾[1]。近年来，研究学者们发现了一种“兼性厌氧反硝化除磷细菌”(DPB)，可以在缺氧条件下，使用硝酸盐作为电子受体氧化胞内贮存的聚羟基脂肪酸酯，并从环境中摄磷、实现同时反硝化和过度摄磷，和传统的好氧吸磷对比，在保证硝化效果的同时减少了系统的消耗,一方面为解决处理含高氮磷工业废水而存在得碳源不足的问题提供了一条实际应用的途径,另一方面剩余的COD也可用于产生甲烷[2]。
1.2 反硝化聚磷菌作用机理
反硝化聚磷菌可以在厌氧状态下，聚磷菌通过糖酵解和水解释放贮存在菌体内部的磷酸盐直接获得能量，形成的能量直接储存于细胞中。得到的能量一部分被用来维持聚磷菌的生存需要，另外一部分则用于聚磷菌合成PHB。而在好氧阶段则可以利用硝酸盐作为电子受体，在将硝酸盐还原成氮气的同时进行超量吸磷作用，从而达到脱氮和除磷的目的[3]。下图为其生物除磷代谢模型。
图1 生物除磷代谢模型
1.3 反硝化除磷的影响因素
生物除磷工艺是目前最经济有效且被广泛认可的一种工艺，该工艺可以在厌氧段和好氧段交错运行，达到富集聚磷菌的目的。但即便在有利于生物除磷系统运行的条件下，同样还是会发生系统除磷效果变得很差甚至毫无结果[4]。目前，主要的影响因素研究有以下几个方面。
1.3.1 碳源的影响
目前，实验室规模的生物除磷系统大都采用乙酸作为唯一碳源进行研究，大多数系统都具有良好稳定的除磷效果。但是近年研究者发现，丙酸作为碳源在长期除磷效果上要优于乙酸。进一步又有人发现采用乙酸和丙酸混合碳源可获得更好的除磷效果，聚磷菌可能占据更大的竞争优势[4]。
葡萄糖是除乙酸之外最被广泛采用的碳源，但是仍存在争议。
1.3.2 起始pH的影响
pH高低影响到菌体生长情况，厌氧段的菌体糖酵解能力改变和好氧阶段的菌体摄磷能力改变对菌株聚磷率和摄磷率的影响很大。
1.3.3 温度的影响
早期报道中，低温环境要比高温环境的除磷效果更佳，但是低温环境时其反应速率会下降。
1.3.4 接种量的影响
接种量的差别直接影响到OD值，但OD值不分死菌活菌，所以对于菌体聚磷率有很大影响。
1.3.5 转速的影响
转速快慢直接影响到菌体生长情况，厌氧段的菌体糖酵解能力改变和好氧阶段的菌体摄磷能力改变对菌株聚磷率和摄磷率的影响很大。
1.4 课题的研究内容
1.4.1 菌株生理生化鉴定
1.4.1.1 生理试验
将两株反硝化聚磷菌株MA-5和X-24稀释涂布培养后，观察其菌落、菌体、褶皱、湿润、凸起、颜色和运动形态。
1.4.1.2 生化试验
2.1 实验材料及仪器
2.1.1 实验材料
菌种：MA-5，X-24。
培养基：⑴ PLB培养基：蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 2%-3%、KH2PO4 25-75-100 mg/L；⑵ 聚磷培养基：MgSO4 82 mg/L、CaCl2 60 mg/L、(NH4)2SO4 0.2 g/L、酵母粉 2 g/L、K2HPO4 50 mg/L、pH 7.0-7.4。（碳源优化时加入相应分子质量的碳源）⑶ 富磷固体培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨6 g/L、KH2PO4 0.02 g/L、琼脂20 g/L、pH 7.2左右。
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