鹅观草内生真菌生物碱合成基因的检测与分析
：禾本科植物内生真菌能够增强宿主植物的抗性，促进植物的生长，提高植物的竞争力。本实验采用多重PCR检测鹅观草Epichlo? yangzii和E. sinicum菌株中的生物碱合成基因。通过对生物碱合成基因簇及基因的检测、测序，了解两种菌生物碱合成基因之间的差异性。并推测其合成生物碱的情况，以及其动物毒性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1菌株材料 2
1.2实验方法2
1.2.1 鹅观草内生真菌检测 2
1.2.2 内生真菌的分离纯化 2
1.2.3提取DNA2
1.2.4 PCR扩增电泳检测及测序 3
2结果与分析3
2.1实验材料来源4
2.2鹅观草内生真菌菌丝形态5
2.3培养的内生真菌菌落5
2.4基因的多重PCR检测5
3讨论7
3.1多重PCR7
3.2鹅观草内生真菌在生物碱合成基因上的差异 7
3.3鹅观草内生真菌生物碱合成预测8
3.4展望9
致谢9
参考文献9
鹅观草内生真菌生物碱合成基因的检测与分析
引言
引言
内生真菌在与宿主植物长期进化过程中可以产生一系列的次生代谢产物，生物碱是其中分布最为广泛的一类 [13] 。一般认为含菌的禾本科植物能够产生抗虫性的主要原因是内生真菌在宿主植物内产生了生物碱。Epichoae 内生真菌产生的次生代谢产物中的生物碱是人们研究的重点[45]。
这些生物碱为麦角类生物碱、吡咯并吡嗪类生物碱、吲哚双萜类生物碱和饱和吡咯化合物生物碱。其中麦角类生物碱和吲哚双萜类生物碱能够造成食草动物中毒，给畜牧业造成了巨大的经济损失；吡咯并吡嗪类生物碱和饱和吡咯化合物生物碱对一些昆虫具有毒性，从而保护植物免受啃食[67]。在
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
四种主要的生物碱中，其中三种由基因簇调控，合成基因具有较长的基因图谱，这与其端粒末端重复序列有关。这些基因簇端粒末端位置对生物碱的多态性有重要作用，并可体现 Epichoae内生真菌的进化关系[8]。目前，美国和新西兰等地的科学家对禾本科植物内生真菌产生的四类生物碱的结构、功能、生物碱合成途径及生物碱合成基因有了较为深入的研究[9]。
本研究探索了生物碱基因在不同鹅观草内生真菌共生体中的分布，为进一步研究鹅观草内生真菌在抗虫性方面优良特性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株材料
分离自鹅观草植株中内生真菌。
1.2 实验方法
1.2.1 鹅观草内生真菌的检测
采用孟加拉红染色法检测内生真菌。用镊子撕取叶鞘内表皮或刮取髓质[10]，在碱性孟加拉红染色液（含1%孟加拉红的1mol/L NaOH溶液）中染色12min，在光学显微镜下检测。
1.2.2 内生真菌的分离，纯化
（1）将镜检含菌植株的茎秆剪成23cm的小段
（2）依次经过75%酒精3min，1%次氯酸钠5min，75%酒精3min浸泡进行表面消毒
（3）再用无菌水洗，用无菌吸水纸吸干表面水分后放置于PDA培养基上
（4）25℃黑暗培养至长出典型的内生真菌菌落
（5）挑取菌丝转接到新的PDA培养基上培养，转接到PDA斜面培养，4℃冷藏保存待用。
1.2.3 提取DNA
（1）将菌丝从平板上刮入离心管中，用液氮研磨成粉末状，称取0.2g粉末于离心管中，加入8001000 μL上海华普公司所售复杂植物DNA提取液，于60°水浴30 min，水浴过程中反复颠倒混匀。
（2）将离心管放入离心机中13000 rpm离心10 min
（3）取上清液，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（V/V/V=25/24/1），颠倒混匀
（4）12000 rpm离心10 min，取上清，加入等体积异丙醇颠倒混匀
（5）弃上清，用800 μL70%乙醇漂洗两次（不要将乙醇洒到盖子上）
（6）在37 ℃下烘干15 min
（7）加入50 μLTE
1.2.4 PCR扩增，电泳检测及测序
以提取的总 DNA 为模板，利用生物碱多重PCR引物进行选择性扩增（表1）。经过1%琼脂糖凝胶电泳检测达到测序要求后，PCR产物直接委托上海美吉生物医药科技有限公司测序。
表1. 标准的PCR反应体系
成分
体积
用途
10X扩增缓冲液
10 μL
缓冲作用，提高扩增效率
4种dNTP混合物
200 μmol/L
合成新链的原材料
引物
10100 pmol
与模板结合
模板DNA
0.12 μg
需扩增的目的DNA片段
Tap DNA聚合酶
2.5 μL
催化新链合成
Mg2=
1.5 mol/L
影响聚合酶活性，提高效率
加蒸馏水补至所需体积
注：以反应体系为100 μL为例，标准的反应体系如表
表2. 多重PCR引物序列表[11]
combinations
Gene
Primer name
Forward primer (5 > 3)
Primer name
Reverse primer (5 > 3)
Size (bp)
Multiplex 1
perAT2
perAT2F
TCTTCAGGCATCGCAGGAAC
perAT2R
TCGGCCACCTCCAGCCTGATG
600
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1菌株材料 2
1.2实验方法2
1.2.1 鹅观草内生真菌检测 2
1.2.2 内生真菌的分离纯化 2
1.2.3提取DNA2
1.2.4 PCR扩增电泳检测及测序 3
2结果与分析3
2.1实验材料来源4
2.2鹅观草内生真菌菌丝形态5
2.3培养的内生真菌菌落5
2.4基因的多重PCR检测5
3讨论7
3.1多重PCR7
3.2鹅观草内生真菌在生物碱合成基因上的差异 7
3.3鹅观草内生真菌生物碱合成预测8
3.4展望9
致谢9
参考文献9
鹅观草内生真菌生物碱合成基因的检测与分析
引言
引言
内生真菌在与宿主植物长期进化过程中可以产生一系列的次生代谢产物，生物碱是其中分布最为广泛的一类 [13] 。一般认为含菌的禾本科植物能够产生抗虫性的主要原因是内生真菌在宿主植物内产生了生物碱。Epichoae 内生真菌产生的次生代谢产物中的生物碱是人们研究的重点[45]。
这些生物碱为麦角类生物碱、吡咯并吡嗪类生物碱、吲哚双萜类生物碱和饱和吡咯化合物生物碱。其中麦角类生物碱和吲哚双萜类生物碱能够造成食草动物中毒，给畜牧业造成了巨大的经济损失；吡咯并吡嗪类生物碱和饱和吡咯化合物生物碱对一些昆虫具有毒性，从而保护植物免受啃食[67]。在
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
四种主要的生物碱中，其中三种由基因簇调控，合成基因具有较长的基因图谱，这与其端粒末端重复序列有关。这些基因簇端粒末端位置对生物碱的多态性有重要作用，并可体现 Epichoae内生真菌的进化关系[8]。目前，美国和新西兰等地的科学家对禾本科植物内生真菌产生的四类生物碱的结构、功能、生物碱合成途径及生物碱合成基因有了较为深入的研究[9]。
本研究探索了生物碱基因在不同鹅观草内生真菌共生体中的分布，为进一步研究鹅观草内生真菌在抗虫性方面优良特性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株材料
分离自鹅观草植株中内生真菌。
1.2 实验方法
1.2.1 鹅观草内生真菌的检测
采用孟加拉红染色法检测内生真菌。用镊子撕取叶鞘内表皮或刮取髓质[10]，在碱性孟加拉红染色液（含1%孟加拉红的1mol/L NaOH溶液）中染色12min，在光学显微镜下检测。
1.2.2 内生真菌的分离，纯化
（1）将镜检含菌植株的茎秆剪成23cm的小段
（2）依次经过75%酒精3min，1%次氯酸钠5min，75%酒精3min浸泡进行表面消毒
（3）再用无菌水洗，用无菌吸水纸吸干表面水分后放置于PDA培养基上
（4）25℃黑暗培养至长出典型的内生真菌菌落
（5）挑取菌丝转接到新的PDA培养基上培养，转接到PDA斜面培养，4℃冷藏保存待用。
1.2.3 提取DNA
（1）将菌丝从平板上刮入离心管中，用液氮研磨成粉末状，称取0.2g粉末于离心管中，加入8001000 μL上海华普公司所售复杂植物DNA提取液，于60°水浴30 min，水浴过程中反复颠倒混匀。
（2）将离心管放入离心机中13000 rpm离心10 min
（3）取上清液，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（V/V/V=25/24/1），颠倒混匀
（4）12000 rpm离心10 min，取上清，加入等体积异丙醇颠倒混匀
（5）弃上清，用800 μL70%乙醇漂洗两次（不要将乙醇洒到盖子上）
（6）在37 ℃下烘干15 min
（7）加入50 μLTE
1.2.4 PCR扩增，电泳检测及测序
以提取的总 DNA 为模板，利用生物碱多重PCR引物进行选择性扩增（表1）。经过1%琼脂糖凝胶电泳检测达到测序要求后，PCR产物直接委托上海美吉生物医药科技有限公司测序。
表1. 标准的PCR反应体系
成分
体积
用途
10X扩增缓冲液
10 μL
缓冲作用，提高扩增效率
4种dNTP混合物
200 μmol/L
合成新链的原材料
引物
10100 pmol
与模板结合
模板DNA
0.12 μg
需扩增的目的DNA片段
Tap DNA聚合酶
2.5 μL
催化新链合成
Mg2=
1.5 mol/L
影响聚合酶活性，提高效率
加蒸馏水补至所需体积
注：以反应体系为100 μL为例，标准的反应体系如表
表2. 多重PCR引物序列表[11]
combinations
Gene
Primer name
Forward primer (5 > 3)
Primer name
Reverse primer (5 > 3)
Size (bp)
Multiplex 1
perAT2
perAT2F
TCTTCAGGCATCGCAGGAAC
perAT2R
TCGGCCACCTCCAGCCTGATG
600
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/255.html
