拟南芥多巴胺β羟化酶的组织表达和调控拟南芥多巴胺β羟化酶的组织表达和调控aba信号的初步研究【字数：5585】
多巴胺β羟化酶 (Dopamine β-hydroxylase,DBH)能够催化多巴胺(Dopamine,DA)转变为去甲肾上腺素（Norrpinephrine,NE）， 属于儿茶酚胺代谢中的生物合成酶。儿茶酚胺是一类含有儿茶酚和胺基的生物胺，包括多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素及它们的衍生物。广泛存在于动物中，能够增强机体在多种应变因素影响下的适应能力。目前研究已发现，儿茶酚胺在植物内有着重要的生理作用，并在植物生长、发育等过程中起着重要的调节作用，参与活性氧清除过程，增强植物对环境的适应性等。该研究主要对拟南芥dbh基因缺失突变体进行PCR鉴定，并且使用GUS染色法分析验证拟南芥中dbh基因的组织表达模式，再通过外源ABA的施加分析DBH对ABA信号的调控作用。最终初步发现，dbh基因在拟南芥中各个组织维管束部位均有表达，而且DBH能够正调控植株对ABA信号的响应。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 研究材料 4
1.2 研究方法 4
1.2.1 拟南芥突变体的鉴定4
1.2.2 转基因材料的构建4
1.2.3 dbh调控ABA诱导保卫细胞的气孔运动4
2 结果与分析5
2.1 实验结果5
2.1.1 拟南芥突变体的鉴定5
2.1.2 dbh基因材料的表达模式5
2.1.3 ABA处理后的拟南芥根部dbh基因表达的相对变化5
2.1.4 dbh调控ABA诱导拟南芥保卫细胞中气孔运动6
2.2 实验结果分析6
2.1.1 TDNA插入突变体的鉴定6
2.1.2 dbh基因材料的表达模式7
2.1.3 dbh基因在ABA处理条件下的表达模式7
2.1.4 dbh基因调控ABA诱导拟南芥保卫细胞孔运动7
3 讨论 7
3.1 dbh基因突变体的鉴定7
3.2 dbh基因的表达模式7
3. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3 dbh基因调控气孔运动8
致谢8
参考文献8
拟南芥多巴胺β羟化酶的组织表达和调控ABA信号的初步研究
引言
引言
1 材料与方法
1．1 研究材料
野生型拟南芥（WT）；DBH缺陷突变体拟南芥（dbh1，dbh2）；大肠杆菌感受态细胞（DH5α）；农杆菌感受态菌株。
1．2 研究方法
1．2．1 拟南芥突变体的鉴定 由于动植物细胞结构不同，植物细胞基因敲除与动物细胞不同。一般采用TDNA插入失活，利用根瘤农杆菌TDNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，这段DNA若插入到目的基因的内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。目前，通过这种TDNA插入失活方法建立了拟南芥大规模基因敲除突变体库。我们设计三条引物LP、RP和LB1.3，LP、RP是根据TDNA插入位点两端约1000bp的拟南芥DNA基因序列上设计的引物，LB1.3是根据TDNA插入载体RB端设计的序列。我们分别提取野生型以及两种缺失突变体的基因组DNA，将引物加入同一反应体系中进行PCR。在野生型植株中，只有LP和RP引物扩增出来的一条约1000bp靶基因条带；如果缺陷突变体是纯合型，那么只有靶基因一端的引物可以与LB引物配对完成扩增，产生一条约400700bp的条带；如果缺陷突变体是杂合型，则会扩增出两条不同长度的条带。同时，为了验证缺陷突变体中DBH基因的相对表达水平，采用RTPCR和qPCR分别进行了验证分析。
1．2．2 转基因材料的构建 提取拟南芥全基因组DNA，取生长到4周的拟南芥叶片，用试剂盒提取出全基因组DNA并存于EP管中，保持﹣20℃冰箱保存。扩增dbh基因启动子，利用Primer5.0软件设计所需引物，选择所需的酶切位点，以获得的全基因组为模板进行基因扩增，并对PCR产物以琼脂糖凝胶电泳进行检测。分析dbh基因的启动子序列，确定启动子序列所包含的元件。将获得的启动子基因序列和质粒采用内切酶进行双酶切，利用连接酶连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，然后涂布于抗性培养基上，37℃过夜培养，挑选单克隆菌落进行PCR鉴定，然后送测序。将测序结果正确的重组质粒转入到农杆菌感受态细胞，通过菌落PCR筛选鉴定阳性单克隆，挑选阳性单菌落培养，采用花序浸花法侵染已开花的野生型拟南芥植株。所收种子春化后撒于抗性培养基上，光照培养10d左右挑选比例接近的3:1的T2代阳性移栽，以获得单拷贝插入的转基因植株继续繁种，直至T3代得到纯合的单拷贝插入的稳定遗传的转基因株系。对获得的转基因株系进行繁种，分别取下植株不同部位的部分，采用组织化学法，用含有反应底物的缓冲液浸泡待检材料，并用体视镜观察结果。
1．2．3 dbh调控ABA诱导保卫细胞的气孔运动 脱落酸（ABA）是一种常见的抑制生长的植物激素。除促使叶子脱落外，还有一个功能就是引起气孔关闭。常被称为胁迫激素，在各种逆境中，ABA的含量都会迅速上升。在拟南芥的保卫细胞中，ABA能够诱导信号分子H2O2和NO的生成，H2O2和NO能够调控促进气孔关闭的生理过程。实验将野生型和两个缺陷突变体拟南芥分别作了对照处理和50μmABA处理。保持单一变量，控制光照和温度湿度等条件。处理2h后，每组选取不同视角的30个气孔分别测量气孔开度并取平均值。
2 结果与分析
2．1 实验结果
2．1．1 拟南芥突变体的鉴定
（A）dbh 突变体 TDNA 插入位点示意图；（B）dbh 突变体的基因组验证；（C、D）dbh 突变体转录水平的验证
图1 dbh突变体的鉴定
2．1．2 dbh基因的表达模式
(A) 主根； (B) 侧根； (C) 子叶； (D) 幼苗；(E) 叶片； (F)保卫细胞；(G) 花； (H) 角果
图2 dbh基因在拟南芥各个部位的表达模式
2．1．3 ABA处理后的拟南芥跟部dbh基因的表达的相对变化
（A）对照组根尖部位；（B）ABA处理后的根尖部位；（C）对照组跟中部；（D）ABA处理后的跟中部
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 研究材料 4
1.2 研究方法 4
1.2.1 拟南芥突变体的鉴定4
1.2.2 转基因材料的构建4
1.2.3 dbh调控ABA诱导保卫细胞的气孔运动4
2 结果与分析5
2.1 实验结果5
2.1.1 拟南芥突变体的鉴定5
2.1.2 dbh基因材料的表达模式5
2.1.3 ABA处理后的拟南芥根部dbh基因表达的相对变化5
2.1.4 dbh调控ABA诱导拟南芥保卫细胞中气孔运动6
2.2 实验结果分析6
2.1.1 TDNA插入突变体的鉴定6
2.1.2 dbh基因材料的表达模式7
2.1.3 dbh基因在ABA处理条件下的表达模式7
2.1.4 dbh基因调控ABA诱导拟南芥保卫细胞孔运动7
3 讨论 7
3.1 dbh基因突变体的鉴定7
3.2 dbh基因的表达模式7
3. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3 dbh基因调控气孔运动8
致谢8
参考文献8
拟南芥多巴胺β羟化酶的组织表达和调控ABA信号的初步研究
引言
引言
1 材料与方法
1．1 研究材料
野生型拟南芥（WT）；DBH缺陷突变体拟南芥（dbh1，dbh2）；大肠杆菌感受态细胞（DH5α）；农杆菌感受态菌株。
1．2 研究方法
1．2．1 拟南芥突变体的鉴定 由于动植物细胞结构不同，植物细胞基因敲除与动物细胞不同。一般采用TDNA插入失活，利用根瘤农杆菌TDNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，这段DNA若插入到目的基因的内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。目前，通过这种TDNA插入失活方法建立了拟南芥大规模基因敲除突变体库。我们设计三条引物LP、RP和LB1.3，LP、RP是根据TDNA插入位点两端约1000bp的拟南芥DNA基因序列上设计的引物，LB1.3是根据TDNA插入载体RB端设计的序列。我们分别提取野生型以及两种缺失突变体的基因组DNA，将引物加入同一反应体系中进行PCR。在野生型植株中，只有LP和RP引物扩增出来的一条约1000bp靶基因条带；如果缺陷突变体是纯合型，那么只有靶基因一端的引物可以与LB引物配对完成扩增，产生一条约400700bp的条带；如果缺陷突变体是杂合型，则会扩增出两条不同长度的条带。同时，为了验证缺陷突变体中DBH基因的相对表达水平，采用RTPCR和qPCR分别进行了验证分析。
1．2．2 转基因材料的构建 提取拟南芥全基因组DNA，取生长到4周的拟南芥叶片，用试剂盒提取出全基因组DNA并存于EP管中，保持﹣20℃冰箱保存。扩增dbh基因启动子，利用Primer5.0软件设计所需引物，选择所需的酶切位点，以获得的全基因组为模板进行基因扩增，并对PCR产物以琼脂糖凝胶电泳进行检测。分析dbh基因的启动子序列，确定启动子序列所包含的元件。将获得的启动子基因序列和质粒采用内切酶进行双酶切，利用连接酶连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，然后涂布于抗性培养基上，37℃过夜培养，挑选单克隆菌落进行PCR鉴定，然后送测序。将测序结果正确的重组质粒转入到农杆菌感受态细胞，通过菌落PCR筛选鉴定阳性单克隆，挑选阳性单菌落培养，采用花序浸花法侵染已开花的野生型拟南芥植株。所收种子春化后撒于抗性培养基上，光照培养10d左右挑选比例接近的3:1的T2代阳性移栽，以获得单拷贝插入的转基因植株继续繁种，直至T3代得到纯合的单拷贝插入的稳定遗传的转基因株系。对获得的转基因株系进行繁种，分别取下植株不同部位的部分，采用组织化学法，用含有反应底物的缓冲液浸泡待检材料，并用体视镜观察结果。
1．2．3 dbh调控ABA诱导保卫细胞的气孔运动 脱落酸（ABA）是一种常见的抑制生长的植物激素。除促使叶子脱落外，还有一个功能就是引起气孔关闭。常被称为胁迫激素，在各种逆境中，ABA的含量都会迅速上升。在拟南芥的保卫细胞中，ABA能够诱导信号分子H2O2和NO的生成，H2O2和NO能够调控促进气孔关闭的生理过程。实验将野生型和两个缺陷突变体拟南芥分别作了对照处理和50μmABA处理。保持单一变量，控制光照和温度湿度等条件。处理2h后，每组选取不同视角的30个气孔分别测量气孔开度并取平均值。
2 结果与分析
2．1 实验结果
2．1．1 拟南芥突变体的鉴定
（A）dbh 突变体 TDNA 插入位点示意图；（B）dbh 突变体的基因组验证；（C、D）dbh 突变体转录水平的验证
图1 dbh突变体的鉴定
2．1．2 dbh基因的表达模式
(A) 主根； (B) 侧根； (C) 子叶； (D) 幼苗；(E) 叶片； (F)保卫细胞；(G) 花； (H) 角果
图2 dbh基因在拟南芥各个部位的表达模式
2．1．3 ABA处理后的拟南芥跟部dbh基因的表达的相对变化
（A）对照组根尖部位；（B）ABA处理后的根尖部位；（C）对照组跟中部；（D）ABA处理后的跟中部
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