高产葡聚糖酶木霉菌株的筛选(附件)
本文主要研究了筛选木霉菌株中高产葡聚糖酶的菌株，从土样中筛选出能在培养基上产生抑菌圈的菌落，发现有4株产葡聚糖酶能力较好，发酵培养，对其酶活鉴定，发现5号样产葡聚糖酶活性最高，其次为6号样，选取5号和6号进行镜检，对照Ainsworth菌物手册进行比对；通过分别提取2株菌的DNA，对其DNA进行PCR扩增，送由上海生工对其进行16S rDNA基因测序，测序结果在NCBI数据库使用BLAST进行对比，确定5号样为棘孢木霉，6号样为哈茨木霉。关键词 葡聚糖酶，木霉，筛选，鉴定
目 录
1 绪论 1
1.1葡聚糖的介绍 1
1.2葡聚糖酶的介绍 3
1.3木霉菌属的介绍 6
1.4本研究的目的意义及主要研究内容 7
2 实验材料及方法 7
2.1实验原料 7
2.2试剂 8
2.3 仪器设备 9
2.4培养基类型 9
2.5实验方法 10
2.6酶活测定方法 10
2.7木霉的鉴定 13
3 分析与结论 15
3.1菌株筛选 15
3.2鉴定 17
结 论 20
致 谢 21
参考文献 22
附 录 24
1 绪论
葡聚糖酶主要存在于一些燕麦、大麦、水稻、小麦等谷物中[1]，应用于酒业的生产，麦芽中的葡聚糖酶不能完全分解葡聚糖，应要添加葡聚糖酶解决麦汁产出率低的问题。家禽的饲料大多也都是这些谷物制成的[24]，其中存在的葡聚糖酶含量较少，酶活力较低，也同样不足以分解葡聚糖，动物食用之后，无法在胃中消化吸收，形成稠状物质，所以也会添加葡聚糖酶[56]，促进饲料的吸收率，减少动物排泄量。
葡聚糖酶在这些常见应用中较为普遍，它作为一种从外添加的酶，引起了大家的重视。如果葡聚糖酶能够进一步减少损耗，成本减少，则它在酒业和饲料行业的应用会更加广泛[7]。所以本文中利用土壤筛菌，再结合现流行的基因工程技术，使高产葡聚糖酶成为可能，在分子生物技术上，生产的葡聚糖酶大多得到了一些使用，这项技术带来葡聚糖酶使用的另一片光明，直接降低了酶的成本[8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
]，使葡聚糖酶的使用更加的广泛。
1.1葡聚糖的介绍
葡聚糖是一种非淀粉性多糖，主要存在于谷物的胚乳和糊粉层的细胞壁中，粘性和亲水性较高。下图1为葡聚糖的结构式。
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图1 葡聚糖的结构
葡聚糖的结构单位是β吡喃葡聚糖，有β1,3和β1,4两种糖苷键连接，在他的结构式中，β1,3和β1,4糖苷键无一定规则排列，β1,4糖苷键构成纤维三糖和纤维四糖[911]，再通过β1,3连接成多聚体形式。
1.1.1葡聚糖的来源
葡聚糖的主要存在谷物中、还有酵母的细胞壁和多种菌菇中[12]，谷物中大 多是β1,3和β1,4两种糖苷键连接，而酵母菌和菌菇中大多是β1,3和β1,6两种糖苷键连接。不同的农作物，其中的葡聚糖含量也不一定相同，由下表1可见燕麦、大麦的葡聚糖含量较高。
表1 常见谷物中葡聚糖含量
谷类作物
葡聚糖含量（g/kg 干物质）
高粱
1.0
玉米
1.0
稻谷
1.0
小麦
5.0
大麦
33.0
燕麦
37.5
黑麦
1243
1.1.2葡聚糖的抗营养作用
1.1.2.1影响营养物质的吸收
动物饲料中添加葡聚糖酶致使葡聚糖酶在肠胃中完全分解，粘稠物质不再粘附在胃中，促进肠胃中的营养物质的吸收[13]。
1.1.2.2影响体内基质的代谢
因为葡聚糖所带有的电荷为负[14]，而体内含有的钙、镁、铁离子为正，两者相吸，所以体内的代谢会受到一定的影响[15]。
1.1.2.3影响肠道内微生物的生长环境
由于粘度较强[16]，其形成的粘稠物质难以消化，就会长时间的停留，这样肠道内微生物就会增多[17]，细菌含量也会增加，肠道菌就会改变，同时葡聚糖还会和体内原有的细菌作用[18]，会发生厌氧发酵，产生一些新的梭状菌，所以影响了营养物质的吸收，动物体的生长也会变得缓慢。
1.1.4葡聚糖的其他影响
葡聚糖在医疗上也有着重大作用，由于它含有β1,3糖苷键，引来了医学人士的目光，因为此糖苷键具有免疫功能，还能抗病毒、抗癌症、抗一些细菌的功能。葡聚糖还具有一定的水溶性，现代人肥胖的居多，将葡聚糖酶添加在他们的食物里，这种可溶性膳食纤维可以促进他们的消化吸收，降低胆固醇，减少心 脏病等发生的可能性[19]。
1.2葡聚糖酶的介绍
1.2.1葡聚糖酶的结构
葡聚糖酶的折叠体系是反向平行的，会有大量的蛋白质存留在每一个折叠的地方，如图2模型。
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图2 葡聚糖酶的立体模型结构
葡聚糖酶是指能够分解由β连接的多聚糖酶，是内切酶和外切酶的总称，作用于葡聚糖的β1,3和β1,4两种糖苷键，使它们分解成寡糖和还原糖。
1.2.2葡聚糖酶的来源和性质
葡聚糖酶的来源主要分为两种，一种是植物，一种是微生物[20]，而植物则是燕麦、大麦等谷类物质中含有，存在胚乳细胞壁上，分解谷物中葡聚糖，促使谷物的正常生长。但其含量较低，无论是用于酿酒还是饲料，都需要添加外源葡聚糖酶，来促进葡聚糖的分解，带来正面作用。而来源于微生物的葡聚糖酶虽然在结构上有差异，但分解的原理相同。所以葡聚糖酶作为一种外源酶，在饲料和酿酒中葡聚糖酶得到了广泛的应用，大大的提高了葡聚糖的分解率[21]。
我们常见的细菌、真菌属等微生物都可以产生葡聚糖酶，但大多数的微生物产生的葡聚糖酶没有特异性，只能分解一些纤维素，而只有在细菌的芽孢菌中和真菌的曲霉中含有特异性的葡聚糖酶[2223]，可分解谷物中的葡聚糖。
目 录
1 绪论 1
1.1葡聚糖的介绍 1
1.2葡聚糖酶的介绍 3
1.3木霉菌属的介绍 6
1.4本研究的目的意义及主要研究内容 7
2 实验材料及方法 7
2.1实验原料 7
2.2试剂 8
2.3 仪器设备 9
2.4培养基类型 9
2.5实验方法 10
2.6酶活测定方法 10
2.7木霉的鉴定 13
3 分析与结论 15
3.1菌株筛选 15
3.2鉴定 17
结 论 20
致 谢 21
参考文献 22
附 录 24
1 绪论
葡聚糖酶主要存在于一些燕麦、大麦、水稻、小麦等谷物中[1]，应用于酒业的生产，麦芽中的葡聚糖酶不能完全分解葡聚糖，应要添加葡聚糖酶解决麦汁产出率低的问题。家禽的饲料大多也都是这些谷物制成的[24]，其中存在的葡聚糖酶含量较少，酶活力较低，也同样不足以分解葡聚糖，动物食用之后，无法在胃中消化吸收，形成稠状物质，所以也会添加葡聚糖酶[56]，促进饲料的吸收率，减少动物排泄量。
葡聚糖酶在这些常见应用中较为普遍，它作为一种从外添加的酶，引起了大家的重视。如果葡聚糖酶能够进一步减少损耗，成本减少，则它在酒业和饲料行业的应用会更加广泛[7]。所以本文中利用土壤筛菌，再结合现流行的基因工程技术，使高产葡聚糖酶成为可能，在分子生物技术上，生产的葡聚糖酶大多得到了一些使用，这项技术带来葡聚糖酶使用的另一片光明，直接降低了酶的成本[8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
]，使葡聚糖酶的使用更加的广泛。
1.1葡聚糖的介绍
葡聚糖是一种非淀粉性多糖，主要存在于谷物的胚乳和糊粉层的细胞壁中，粘性和亲水性较高。下图1为葡聚糖的结构式。
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图1 葡聚糖的结构
葡聚糖的结构单位是β吡喃葡聚糖，有β1,3和β1,4两种糖苷键连接，在他的结构式中，β1,3和β1,4糖苷键无一定规则排列，β1,4糖苷键构成纤维三糖和纤维四糖[911]，再通过β1,3连接成多聚体形式。
1.1.1葡聚糖的来源
葡聚糖的主要存在谷物中、还有酵母的细胞壁和多种菌菇中[12]，谷物中大 多是β1,3和β1,4两种糖苷键连接，而酵母菌和菌菇中大多是β1,3和β1,6两种糖苷键连接。不同的农作物，其中的葡聚糖含量也不一定相同，由下表1可见燕麦、大麦的葡聚糖含量较高。
表1 常见谷物中葡聚糖含量
谷类作物
葡聚糖含量（g/kg 干物质）
高粱
1.0
玉米
1.0
稻谷
1.0
小麦
5.0
大麦
33.0
燕麦
37.5
黑麦
1243
1.1.2葡聚糖的抗营养作用
1.1.2.1影响营养物质的吸收
动物饲料中添加葡聚糖酶致使葡聚糖酶在肠胃中完全分解，粘稠物质不再粘附在胃中，促进肠胃中的营养物质的吸收[13]。
1.1.2.2影响体内基质的代谢
因为葡聚糖所带有的电荷为负[14]，而体内含有的钙、镁、铁离子为正，两者相吸，所以体内的代谢会受到一定的影响[15]。
1.1.2.3影响肠道内微生物的生长环境
由于粘度较强[16]，其形成的粘稠物质难以消化，就会长时间的停留，这样肠道内微生物就会增多[17]，细菌含量也会增加，肠道菌就会改变，同时葡聚糖还会和体内原有的细菌作用[18]，会发生厌氧发酵，产生一些新的梭状菌，所以影响了营养物质的吸收，动物体的生长也会变得缓慢。
1.1.4葡聚糖的其他影响
葡聚糖在医疗上也有着重大作用，由于它含有β1,3糖苷键，引来了医学人士的目光，因为此糖苷键具有免疫功能，还能抗病毒、抗癌症、抗一些细菌的功能。葡聚糖还具有一定的水溶性，现代人肥胖的居多，将葡聚糖酶添加在他们的食物里，这种可溶性膳食纤维可以促进他们的消化吸收，降低胆固醇，减少心 脏病等发生的可能性[19]。
1.2葡聚糖酶的介绍
1.2.1葡聚糖酶的结构
葡聚糖酶的折叠体系是反向平行的，会有大量的蛋白质存留在每一个折叠的地方，如图2模型。
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图2 葡聚糖酶的立体模型结构
葡聚糖酶是指能够分解由β连接的多聚糖酶，是内切酶和外切酶的总称，作用于葡聚糖的β1,3和β1,4两种糖苷键，使它们分解成寡糖和还原糖。
1.2.2葡聚糖酶的来源和性质
葡聚糖酶的来源主要分为两种，一种是植物，一种是微生物[20]，而植物则是燕麦、大麦等谷类物质中含有，存在胚乳细胞壁上，分解谷物中葡聚糖，促使谷物的正常生长。但其含量较低，无论是用于酿酒还是饲料，都需要添加外源葡聚糖酶，来促进葡聚糖的分解，带来正面作用。而来源于微生物的葡聚糖酶虽然在结构上有差异，但分解的原理相同。所以葡聚糖酶作为一种外源酶，在饲料和酿酒中葡聚糖酶得到了广泛的应用，大大的提高了葡聚糖的分解率[21]。
我们常见的细菌、真菌属等微生物都可以产生葡聚糖酶，但大多数的微生物产生的葡聚糖酶没有特异性，只能分解一些纤维素，而只有在细菌的芽孢菌中和真菌的曲霉中含有特异性的葡聚糖酶[2223]，可分解谷物中的葡聚糖。
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