紫背天葵叶片sod酶基因克隆
摘要：超氧化物歧化酶(SOD)是一种能清除逆境条件下细胞内活性氧的关键酶, 与植物的抗逆性密切相关。本实验以紫背天葵（Gynura bicolor D.C）为研究对象，用改良CTAB法提取紫背天葵叶片的总RNA，通过PCR扩增、RACE扩增和克隆测序，得到一条长为924bp的SOD的全长序列。对获得的氨基酸序列在NCBI数据库进行BLAST，结果表明紫背天葵Cu/Zn-SOD与向日葵、薇甘菊、一枝黄花Cu/Zn-SOD有较高的同源性，为87%。通过构建进化树得出紫背天葵与菊科的一枝黄花、向日葵和薇甘菊聚为一支，与杨柳科和茄科的亲缘关系较近。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.1.1 实验用具及试剂 4
1.1.2 仪器4
1.1.3 实验材料4
1.2 方法4
1.2.1 总RNA提取4
1.2.2 1.5%琼脂糖凝胶电泳5
1.2.3 微量分光光度计测定RNA浓度及纯度 5
1.2.4 cDNA第一链的合成 5
1.2.5 紫背天葵SOD基因克隆PCR反应 5
1.2.6 凝胶电泳中DNA片段的回收 6
1.2.7 DNA片段与克隆载体的连接 6
1.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 6
1.2.9 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 6
1.2.10 菌液PCR鉴定目的片段 6
1.2.11 用Takara反应体系进行RACEPCR 6
1.2.12 凝胶电泳中DNA片段的回收 6
1.2.13 DNA片段与克隆载体的连接 7
1.2.14大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 7
1.2.15 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 7
1.2.16 菌液PCR鉴定目的片段 7
1.2.17 生物信息学分析 7
2 结果 7
2.1 总RNA提取质量检测
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
7
2.2 Cu/ZnSOD cDNA 基因中间保守片段的扩增 7
2.3 Cu/ZnSOD基因3’端克隆 8
2.4 Cu/ZnSOD基因5’端克隆 8
2.5 mRNA序列分析 8
2.6 Cu/ZnSOD氨基酸序列同源性比较及多序列比对 10
2.7 Cu/ZnSOD系统进化分析 11
3 讨论 12
致谢12
参考文献13
紫背天葵叶片SOD酶基因克隆
引言
引言
紫背天葵(Gynura bicolor D.C)，为菊科三七草属多年生宿根草本植物。因其病虫害少，用药少，与荠菜、马兰头、枸杞头等绿叶蔬菜一样，自古以来就作为风味蔬菜，是药食同源的特色蔬菜[1]。紫背天葵叶片含有丰富的天然蛋白质，食用纤维，油脂，氨和类黄酮[23]。在亚洲广泛被用作民间医药，抗氧化剂和天然色素[4]。于是，紫背天葵叶片的生产和消费在逐年快速增加[5]。迄今为止，国内外工作者对紫背天葵的研究主要集中在其营养价值，抗氧化机制[6]，萃取花青素[7]和类黄酮[8]，但是在紫背天葵基因分子和抗逆分子方面的研究相关报道较少。因此，从分子水平对紫背天葵进行研究具有重要的现实意义。
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是一种氧自由基的清除剂，能去除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，有效防止生物分子被氧化[9]。在植物活性氧清除系统中，SOD是首先发挥作用的抗氧化酶，能够催化植物体内超氧阴离子自由基的歧化反应，减少自由基的毒害，维持细胞膜结构和功能的稳定性，增强植物的抗逆性[10]。其在植物体中的高量或超量表达可以改善植物在逆境胁迫下清除活性氧的能力。SOD根据其酶活性中心辅基结合不同的金属离子，分为Cu/ZnSOD、FeSOD和MnSOD 3种[11]。Cu/ZnSOD是植物叶片中主要含有的，存在于叶绿体和细胞质中，与植物的抗寒、抗旱、耐盐碱等多种抗逆性关系密切[1214]。植物在生长过程中易遭受高温、低温、干旱、洪涝及病原菌等不良因素的影响[15]，因此逆境条件下，植物体内是否能维持较高的SOD活性水平密切关系到植物的抗性。本实验课题通过对紫背天葵叶片SOD酶的基因克隆，扩增出SOD基因，为今后能够进一步研究其在紫背天葵中对生物和非生物胁迫的应答反应机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验器材及试剂
实验器材：研钵、研棒、钥匙、小刀、2mL离心管、200uLEP管、移液枪（1000uL、100uL、10uL）、枪头（1mL、100uL、10uL）、三角瓶。
试剂：氯仿/异戊醇（24:1）、8mol/L Licl溶液、无水乙醇、75%乙醇、TrisHCL溶液、CTAB提取液、SSTE buffer溶液、0.5mol/L EDTA溶液、10%SDS溶液、10%TAE缓冲液、克隆载体pMD19T Vector、cDNA反转录试剂盒、PCR试剂盒、青霉素、DNA marker等。
1.1.2 仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
数显恒温水浴锅（HH6 常州国华电器有限公司 常州）；
恒温磁力搅拌器（851 常州国华电器有限公司 常州）；
高速冷冻离心机（GL20GⅡ 上海安亭科学仪器厂 上海）；
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；
微型旋涡混合仪（XW80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY10C 北京市六一仪器厂 北京）
隔水式恒温培养箱（GRP9160型 上海森信实验仪器有限公司 上海）
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）
微量分光光度计（NANODROP 2000 Thermo）
紫外凝胶成像仪（Universal Hood II BIORAD）
1.1.3 实验材料
实验所用材料为新鲜的无机械损伤的紫背天葵叶片，摘取嫩叶的叶片上三分之一处，分别切碎后用保鲜膜和锡纸包裹好，用液氮速冻后放入20℃的冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取
方法：改良CTAB法[16]
1）对试验所用的金属、玻璃和塑料制品进行高温高压灭菌，烘干后备用；
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.1.1 实验用具及试剂 4
1.1.2 仪器4
1.1.3 实验材料4
1.2 方法4
1.2.1 总RNA提取4
1.2.2 1.5%琼脂糖凝胶电泳5
1.2.3 微量分光光度计测定RNA浓度及纯度 5
1.2.4 cDNA第一链的合成 5
1.2.5 紫背天葵SOD基因克隆PCR反应 5
1.2.6 凝胶电泳中DNA片段的回收 6
1.2.7 DNA片段与克隆载体的连接 6
1.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 6
1.2.9 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 6
1.2.10 菌液PCR鉴定目的片段 6
1.2.11 用Takara反应体系进行RACEPCR 6
1.2.12 凝胶电泳中DNA片段的回收 6
1.2.13 DNA片段与克隆载体的连接 7
1.2.14大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 7
1.2.15 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 7
1.2.16 菌液PCR鉴定目的片段 7
1.2.17 生物信息学分析 7
2 结果 7
2.1 总RNA提取质量检测
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
7
2.2 Cu/ZnSOD cDNA 基因中间保守片段的扩增 7
2.3 Cu/ZnSOD基因3’端克隆 8
2.4 Cu/ZnSOD基因5’端克隆 8
2.5 mRNA序列分析 8
2.6 Cu/ZnSOD氨基酸序列同源性比较及多序列比对 10
2.7 Cu/ZnSOD系统进化分析 11
3 讨论 12
致谢12
参考文献13
紫背天葵叶片SOD酶基因克隆
引言
引言
紫背天葵(Gynura bicolor D.C)，为菊科三七草属多年生宿根草本植物。因其病虫害少，用药少，与荠菜、马兰头、枸杞头等绿叶蔬菜一样，自古以来就作为风味蔬菜，是药食同源的特色蔬菜[1]。紫背天葵叶片含有丰富的天然蛋白质，食用纤维，油脂，氨和类黄酮[23]。在亚洲广泛被用作民间医药，抗氧化剂和天然色素[4]。于是，紫背天葵叶片的生产和消费在逐年快速增加[5]。迄今为止，国内外工作者对紫背天葵的研究主要集中在其营养价值，抗氧化机制[6]，萃取花青素[7]和类黄酮[8]，但是在紫背天葵基因分子和抗逆分子方面的研究相关报道较少。因此，从分子水平对紫背天葵进行研究具有重要的现实意义。
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是一种氧自由基的清除剂，能去除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，有效防止生物分子被氧化[9]。在植物活性氧清除系统中，SOD是首先发挥作用的抗氧化酶，能够催化植物体内超氧阴离子自由基的歧化反应，减少自由基的毒害，维持细胞膜结构和功能的稳定性，增强植物的抗逆性[10]。其在植物体中的高量或超量表达可以改善植物在逆境胁迫下清除活性氧的能力。SOD根据其酶活性中心辅基结合不同的金属离子，分为Cu/ZnSOD、FeSOD和MnSOD 3种[11]。Cu/ZnSOD是植物叶片中主要含有的，存在于叶绿体和细胞质中，与植物的抗寒、抗旱、耐盐碱等多种抗逆性关系密切[1214]。植物在生长过程中易遭受高温、低温、干旱、洪涝及病原菌等不良因素的影响[15]，因此逆境条件下，植物体内是否能维持较高的SOD活性水平密切关系到植物的抗性。本实验课题通过对紫背天葵叶片SOD酶的基因克隆，扩增出SOD基因，为今后能够进一步研究其在紫背天葵中对生物和非生物胁迫的应答反应机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验器材及试剂
实验器材：研钵、研棒、钥匙、小刀、2mL离心管、200uLEP管、移液枪（1000uL、100uL、10uL）、枪头（1mL、100uL、10uL）、三角瓶。
试剂：氯仿/异戊醇（24:1）、8mol/L Licl溶液、无水乙醇、75%乙醇、TrisHCL溶液、CTAB提取液、SSTE buffer溶液、0.5mol/L EDTA溶液、10%SDS溶液、10%TAE缓冲液、克隆载体pMD19T Vector、cDNA反转录试剂盒、PCR试剂盒、青霉素、DNA marker等。
1.1.2 仪器
精密电子天平（DJ300 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海）；
数显恒温水浴锅（HH6 常州国华电器有限公司 常州）；
恒温磁力搅拌器（851 常州国华电器有限公司 常州）；
高速冷冻离心机（GL20GⅡ 上海安亭科学仪器厂 上海）；
台面式pH/ISE测试仪（Orion86802 上海纳锘仪器有限公司 美国）；
微型旋涡混合仪（XW80A 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG9030A 上海益恒实验仪器有限公司 上海）；
电泳仪（DYY10C 北京市六一仪器厂 北京）
隔水式恒温培养箱（GRP9160型 上海森信实验仪器有限公司 上海）
PCR仪（2720 Theral Cycler Applied Biosystems）
微量分光光度计（NANODROP 2000 Thermo）
紫外凝胶成像仪（Universal Hood II BIORAD）
1.1.3 实验材料
实验所用材料为新鲜的无机械损伤的紫背天葵叶片，摘取嫩叶的叶片上三分之一处，分别切碎后用保鲜膜和锡纸包裹好，用液氮速冻后放入20℃的冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取
方法：改良CTAB法[16]
1）对试验所用的金属、玻璃和塑料制品进行高温高压灭菌，烘干后备用；
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