细胞力学微环境对神经干细胞向神经元定向分化的影响(附件)
神经干细胞（NSC）是一种具有长期自我更新和分化能力的原始神经细胞，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。本文突破宏观尺度的传统设计理念，借助SH-SY5Y细胞这种NSC，从新型软弹性光交联明胶的合成、载SH-SY5Y细胞水凝胶微砖的制备、细胞外三维微环境对SH-SY5Y分化的影响这三方面进行研究，精确模拟SH-SY5Y细胞的天然三维微环境，实现在微观水平构建具有定向诱导功能的神经微组织支架，并探索了力学微环境调控SH-SY5Y细胞生长和分化的规律和机制，从理论层面揭示力学微环境对SH-SY5Y细胞行为的影响规律和机制。结果发现，通过降低光交联基团的取代度、天然高分子的浓度，可以有效降低光交联密度，从而降低机械强度，提高溶胀程度，减少降解时间，更有利于在人体内组织再生及支持神经干细胞向神经元定向分化。本文也证明了GelMA材料具有良好的生物相容性，可以很好地支持神经干细胞的生长繁殖及分化。此外，用B27替代血清且加入诱导剂TPA、RA可以有效诱导SH-SY5Y细胞定向分化为神经元。本文的研究结果将为解决临床NSC移植促进脑组织再生问题、甚至中枢神经系统组织再生问题提供重要参考。
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1材料与方法5
1.1.1 主要实验材料 5
1.1.2 实验试剂及材料配制5
1.1.3主要实验仪器6
1.2 实验方法6
1.2.1新型光交联明胶（GelMA）的合成及性能分析6
1.2.2神经干细胞培养及传代7
1.2.3 载SHSY5Y细胞GelMA微砖的构建7
1.2.4载SHSY5Y细胞GelMA微砖的理化性能表征 7
1.2.5载SHSY5Y细胞GelMA微砖的体外细胞评价7
1.2.6不同分化培养基对SHSY5Y细胞定向分化为神经元的影响7
2 结果与分析8
2.1 新型光交联明胶（GelMA）的合成及性能分析 8
2.2 GelMA微砖的理化性能表征 8
2.2.1力学性能分析 8
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2.2.2 溶胀性能分析 9
2.2.3 降解性能分析10
2.3 载SHSY5Y细胞GelMA微砖的体外细胞分析 11
2.3.1细胞活性分析 11
2.3.2细胞形态分析 13
2.3.3细胞增殖分析 14
2.3.4细胞分化分析 16
3 讨论19
4 结论21
致谢21
参考文献22
细胞力学微环境对神经干细胞向神经元定向分化的影响
引言
引言
神经干细胞（NSC）是一种具有长期自我更新和分化能力的原始神经细胞，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。将其植入受损脑组织后，可以代替损伤和丢失的神经细胞；同时，整合到宿主的大脑中可以重建受损的神经环路，支持和调动内源性神经细胞的修复反应（如轴突生长和神经元链状排列）；另外，还能保护神经元和减轻脑损伤后的炎症反应[1]。因此，NSC在治疗脑损伤方面(如创伤后脑损伤)有很大的应用潜力。前期研究表明，NSC外三维微环境决定了NSC的存活、生长和定向分化等细胞行为及功能。适宜细胞外微环境的缺失会使NSC向神经元的分化、神经元的成熟和轴突的定向生长及链状排列受到阻碍，从而负面影响神经细胞的电传导功能[2]。因此，研发出可提供支持NSC存活和生长并引导NSC定向分化为功能性神经元的三维微环境，将对利用NSC治疗脑损伤等疾病有非常重大的临床意义。亟需选用一种合适的NSC做临床前研究。
本课题选用的神经干细胞（NSC）为人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞，该细胞具有神经瘤样细胞特征。它含有小而圆的胞体，伸出较短的轴突，有较少的胞质和树突样突起，且呈簇状生长，其形态可随着培养时间的延长而发生变化[3]。此外，SHSY5Y 细胞来自于不成熟的肿瘤性神经嵴细胞，表达干细胞的特征，许多分化诱导剂均能诱导SHSY5Y 细胞分化为具有功能的成熟神经元表现型。因此，SHSYSY细胞可以作为研究诱导神经母细胞瘤分化机制的理想模型。但单纯的细胞植入体内进行修复时会出现存活率偏低、不易大量分化的情况，因此需要支架材料来进行负载和引导其生长、分化。
多种生物材料支架如纳米纤维膜、多孔支架、水凝胶等已作为培养NSC的支架。这些支架中，水凝胶的含水量和力学性能经调控可接近天然脑组织，因此成为一种非常有潜力的SHSY5Y细胞培养支架[46]。此外，水凝胶还能同时装载各种生长因子，促进SHSY5Y细胞的生长和分化[7]。目前，水凝胶如海藻酸钠[8]、透明质酸[5]、纤维蛋白[4]、胶原蛋白[9]、明胶[10]等已被用于培养SHSY5Y细胞，并取得了较好的效果。通过调控这些水凝胶支架的弹性模量可以调控所装载SHSY5Y的形态、生长、分化以及分化的神经元突起（树突和轴突）的生长[11]，从而影响分化神经元的电传导功能。例如，调节水凝胶的弹性模量至0.1~2kPa时[12]，将会诱导βIII微管蛋白和MAP－2等与神经元成熟早期相关蛋白的大量表达[13]。与550Pa的水凝胶相比，50Pa的聚丙烯酰胺凝胶能够明显促进神经突分支[14]。尽管调控水凝胶的模量，能在一定水平上调控SHSY5Y细胞的行为，但是，由于SHSY5Y细胞在培养过程中容易发生团聚，可能负面影响SHSY5Y细胞向神经元的分化以及分化的神经元的链状连接，仅通过调控水凝胶支架的弹性模量，并不足以诱导SHSY5Y细胞向神经元分化和神经元的成熟和轴突的定向生长。前期研究证明，在二维培养中，拉伸刺激会显著提高SHSY5Y细胞向神经元分化的效率，并诱导神经元的成熟和轴突的定向伸长。但是，利用拉伸刺激来提高神经元分化的效率在水凝胶材料中鲜有报道。这是因为常用的水凝胶支架如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、海藻酸钠等均为软且脆的材料，难以进行拉伸试验。因此，合成一种能支持NSC粘附生长且具有软弹性的水凝胶材料，将能模拟SHSY5Y细胞生长的天然环境，并通过给支架提供进一步的力学刺激（如拉伸刺激），将有望提高SHSY5Y细胞向神经元分化的效率，并诱导神经元的成熟和轴突的定向伸长。
前期研究表明，在明胶中引入光交联基团（取代明胶中的氨基）可以调控材料的力学性能（如弹性模量和拉伸强度），因此，该方法有望用于改善明胶性能，从而构建能支持SHSY5Y细胞粘附生长且具有软弹性的水凝胶。光交联明胶既包含明胶具备的生物相容性、可降解性等优良特性，又有光交联基团的可光交联特性，液态的光交联明胶经紫外照射可在几秒内迅速固化[15, 16]。通过改变明胶高分子链中光交联基团的取代度以及光交联明胶的浓度，可以调控材料的力学性能、降解性能和相关生物学性能[15, 16]。因此，合成一种新型软弹性光交联明胶，有望能模拟SHSY5Y细胞生长的天然环境，通过进一步给予光交联明胶拉伸刺激，将有望提高SHSY5Y细胞向神经元分化的效率，并诱导神经元的成熟和轴突的定向伸长。
同时，相关研究表明，神经母细胞瘤株SHSY5Y细胞经十四烷酰佛波醇乙酸酯（TPA）、全反式维甲酸(RA)处理后，胞体两端突起显著增长，表明神经干细胞正在向成熟神经元表现型方向分化[17]，因此可以通过添加这两种物质来诱导SHSY5Y细胞的分化。
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1材料与方法5
1.1.1 主要实验材料 5
1.1.2 实验试剂及材料配制5
1.1.3主要实验仪器6
1.2 实验方法6
1.2.1新型光交联明胶（GelMA）的合成及性能分析6
1.2.2神经干细胞培养及传代7
1.2.3 载SHSY5Y细胞GelMA微砖的构建7
1.2.4载SHSY5Y细胞GelMA微砖的理化性能表征 7
1.2.5载SHSY5Y细胞GelMA微砖的体外细胞评价7
1.2.6不同分化培养基对SHSY5Y细胞定向分化为神经元的影响7
2 结果与分析8
2.1 新型光交联明胶（GelMA）的合成及性能分析 8
2.2 GelMA微砖的理化性能表征 8
2.2.1力学性能分析 8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
2.2.2 溶胀性能分析 9
2.2.3 降解性能分析10
2.3 载SHSY5Y细胞GelMA微砖的体外细胞分析 11
2.3.1细胞活性分析 11
2.3.2细胞形态分析 13
2.3.3细胞增殖分析 14
2.3.4细胞分化分析 16
3 讨论19
4 结论21
致谢21
参考文献22
细胞力学微环境对神经干细胞向神经元定向分化的影响
引言
引言
神经干细胞（NSC）是一种具有长期自我更新和分化能力的原始神经细胞，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。将其植入受损脑组织后，可以代替损伤和丢失的神经细胞；同时，整合到宿主的大脑中可以重建受损的神经环路，支持和调动内源性神经细胞的修复反应（如轴突生长和神经元链状排列）；另外，还能保护神经元和减轻脑损伤后的炎症反应[1]。因此，NSC在治疗脑损伤方面(如创伤后脑损伤)有很大的应用潜力。前期研究表明，NSC外三维微环境决定了NSC的存活、生长和定向分化等细胞行为及功能。适宜细胞外微环境的缺失会使NSC向神经元的分化、神经元的成熟和轴突的定向生长及链状排列受到阻碍，从而负面影响神经细胞的电传导功能[2]。因此，研发出可提供支持NSC存活和生长并引导NSC定向分化为功能性神经元的三维微环境，将对利用NSC治疗脑损伤等疾病有非常重大的临床意义。亟需选用一种合适的NSC做临床前研究。
本课题选用的神经干细胞（NSC）为人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞，该细胞具有神经瘤样细胞特征。它含有小而圆的胞体，伸出较短的轴突，有较少的胞质和树突样突起，且呈簇状生长，其形态可随着培养时间的延长而发生变化[3]。此外，SHSY5Y 细胞来自于不成熟的肿瘤性神经嵴细胞，表达干细胞的特征，许多分化诱导剂均能诱导SHSY5Y 细胞分化为具有功能的成熟神经元表现型。因此，SHSYSY细胞可以作为研究诱导神经母细胞瘤分化机制的理想模型。但单纯的细胞植入体内进行修复时会出现存活率偏低、不易大量分化的情况，因此需要支架材料来进行负载和引导其生长、分化。
多种生物材料支架如纳米纤维膜、多孔支架、水凝胶等已作为培养NSC的支架。这些支架中，水凝胶的含水量和力学性能经调控可接近天然脑组织，因此成为一种非常有潜力的SHSY5Y细胞培养支架[46]。此外，水凝胶还能同时装载各种生长因子，促进SHSY5Y细胞的生长和分化[7]。目前，水凝胶如海藻酸钠[8]、透明质酸[5]、纤维蛋白[4]、胶原蛋白[9]、明胶[10]等已被用于培养SHSY5Y细胞，并取得了较好的效果。通过调控这些水凝胶支架的弹性模量可以调控所装载SHSY5Y的形态、生长、分化以及分化的神经元突起（树突和轴突）的生长[11]，从而影响分化神经元的电传导功能。例如，调节水凝胶的弹性模量至0.1~2kPa时[12]，将会诱导βIII微管蛋白和MAP－2等与神经元成熟早期相关蛋白的大量表达[13]。与550Pa的水凝胶相比，50Pa的聚丙烯酰胺凝胶能够明显促进神经突分支[14]。尽管调控水凝胶的模量，能在一定水平上调控SHSY5Y细胞的行为，但是，由于SHSY5Y细胞在培养过程中容易发生团聚，可能负面影响SHSY5Y细胞向神经元的分化以及分化的神经元的链状连接，仅通过调控水凝胶支架的弹性模量，并不足以诱导SHSY5Y细胞向神经元分化和神经元的成熟和轴突的定向生长。前期研究证明，在二维培养中，拉伸刺激会显著提高SHSY5Y细胞向神经元分化的效率，并诱导神经元的成熟和轴突的定向伸长。但是，利用拉伸刺激来提高神经元分化的效率在水凝胶材料中鲜有报道。这是因为常用的水凝胶支架如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、海藻酸钠等均为软且脆的材料，难以进行拉伸试验。因此，合成一种能支持NSC粘附生长且具有软弹性的水凝胶材料，将能模拟SHSY5Y细胞生长的天然环境，并通过给支架提供进一步的力学刺激（如拉伸刺激），将有望提高SHSY5Y细胞向神经元分化的效率，并诱导神经元的成熟和轴突的定向伸长。
前期研究表明，在明胶中引入光交联基团（取代明胶中的氨基）可以调控材料的力学性能（如弹性模量和拉伸强度），因此，该方法有望用于改善明胶性能，从而构建能支持SHSY5Y细胞粘附生长且具有软弹性的水凝胶。光交联明胶既包含明胶具备的生物相容性、可降解性等优良特性，又有光交联基团的可光交联特性，液态的光交联明胶经紫外照射可在几秒内迅速固化[15, 16]。通过改变明胶高分子链中光交联基团的取代度以及光交联明胶的浓度，可以调控材料的力学性能、降解性能和相关生物学性能[15, 16]。因此，合成一种新型软弹性光交联明胶，有望能模拟SHSY5Y细胞生长的天然环境，通过进一步给予光交联明胶拉伸刺激，将有望提高SHSY5Y细胞向神经元分化的效率，并诱导神经元的成熟和轴突的定向伸长。
同时，相关研究表明，神经母细胞瘤株SHSY5Y细胞经十四烷酰佛波醇乙酸酯（TPA）、全反式维甲酸(RA)处理后，胞体两端突起显著增长，表明神经干细胞正在向成熟神经元表现型方向分化[17]，因此可以通过添加这两种物质来诱导SHSY5Y细胞的分化。
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