饲料中黄曲霉毒素B1检测方法的研究
目录
1 引言 1
1.1 黄曲霉毒素的检测 1
1.1.1 黄曲霉毒素的性质介绍 1
1.1.2 黄曲霉毒素的检测方法 2
1.1.2.1 薄层层析法（TLC法） 2
1.1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA） 2
1.1.2.3 Charm ROSA试剂条法 3
1.1.2.4 微柱法 3
1.1.2.5 高效液相色谱法（HPLC） 3
1.1.3 小结 4
2 材料与方法 4
2.1 薄层色谱法定性检测黄曲霉毒素B1 4
2.1.1 实验材料 4
2.1.1.1 药品与试剂 4
2.1.1.2 实验样品 4
2.1.1.3 溶液配置 4
2.1.2 薄层色谱法的定性检测原理 5
2.1.3 实验方法 5
2.1.3.1 样品的提取 5
2.1.3.2 操作步骤 5
2.2 酶联免疫吸附法定量检测黄曲霉毒素B1 6
2.2.1 实验材料 6
2.2.1.1 药品与仪器 6
2.2.1.2 溶液配置 6
2.2.1.3 酶联分析步骤 6
2.2.1.4 酶标板的最适甲醇浓度的测试 7
2.2.1.5 多种样品的定量检测 7
2.3 Charm ROSA试剂条法定量黄曲霉毒素B1 7
2.3.1 实验材料 7
2.3.1.1 实验样品及试剂 7
2.3.1.2 样品处理流程 7
2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
.3.1.3 检测步骤 7
3 结果分析 8
3.1 薄层层析方法结果分析 8
3.1.1 最低检出量的测定 8
3.2 酶联免疫吸附法的结果分析 8
3.2.1 黄曲霉标准曲线绘制 8
3.2.2 酶标板的最适检测液-甲醇浓度的测试 9
3.2.3 多种样品的检测结果 9
3.3 试剂条法的结果分析 9
4 讨论 10
结 论 12
致 谢 13
参 考 文 献 14
1 引言
黄曲霉毒素是一种毒性和继发曲霉菌和曲霉菌产生的代谢产物。在世界的不同地方，食品安全问题已成为食品的一个热点，它是在供人类消费的食物中发现的。自上世纪60年代以来，黄曲霉毒素的危害主要是黄曲霉毒素的报道，这已成为一种毒素在大多数人的关注。其中黄曲霉毒素B1污染的物质，广泛存在于谷物和饲料及其加工产品在目前已知的200种霉菌毒素中毒性最强，最高频率的污染。
目前，黄曲霉毒素B1的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法和酶联法等。这些方法因受实验本身的限制，精确度低；样品前处理过程复杂，浪费时间；检测设备仪器价格昂贵，难以推广，导致饲料中的黄曲霉毒素无法被准确的检测出来。因此，对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析时，使用准确、快速、简便的方法，是研究黄曲霉毒素的一个重要方面。
1.1 黄曲霉毒素的检测
1.1.1 黄曲霉毒素的性质介绍
迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等17种结构相似且特征已知的化合物。黄曲霉是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，无色无味，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，前者为基本结构，后者与致癌有关。
表1 我国对黄曲霉毒素B1在各种食品和饲料中含量限量标准
产品名称 限量标准(μg/kg) 试验方法
黄曲霉毒素B1允许量(μg/kg) 花生、花生仁、花生油 ≤20 GB/T17480或GB/T8381
玉米及其制品 ≤20
大米及其他食用植物油 ≤10
其他粮食、豆类及发酵类食品 ≤5
酱油、醋等调味品 ≤5
婴儿代乳食品 不得检出
黄曲霉毒素的理化性质比较稳定，如B1在高温200℃、紫外线照射下，都不能使之破坏，加热到B1的熔点（268-269℃）才开始分解；易溶于甲醇、二甲基甲酰胺、氯仿，难溶于己烷、石油醚等；在酸性溶液中，黄曲霉毒素B1也很稳定，在PH 1—3的强酸性溶液中则稍有分解[1]。黄曲霉毒素的毒性是氰化钾毒性的10倍，是砒霜的68倍，与人的肝癌有密切关系，能使家畜、家禽及多种实验动物诱发癌症，其中B1、B2、G1、G2的毒性比较大，而B1是迄今发现的各种真菌毒素中化学性质最稳定的一种[2,3]。
1.1.2 黄曲霉毒素的检测方法
黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，新的化学检测手段和新仪器的出现，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求[4]。
1.1.2.1 薄层层析法（TLC法）
薄层层析法是传统的检测黄曲霉毒素常用方法。该方法原理是：样品经提取、浓缩、薄层分离后，在紫外光照射下（波长365nm），黄曲霉毒素显示紫色荧光。根据其所显示荧光的最低量来检测出试样中黄曲霉毒素的含量，属于定性和半定量分析方法。其优点是试验设备简单低廉，操作方法简单易行，容易操作。目前我国检测各类粮食食品级饲料主要应用此方法，所有旧版国家标准都是依据此原理设计的检验方法。但是近年的研究工作主要集中在改进样品样品的提取和净化方法，改善薄层色谱条件和分离方法。样品前处理较繁琐，而且不能准确定量分析。
1.1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）
ELISA方法是20世纪70年代来发展起来的一种新的分析方法，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定性或定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原。我国也有以ELISA检测食品及饲料中AFB1的研究报道。酶联免疫吸附分析法也成为我国检测食品和饲料中 AFB1含量的标准方法（GB/T 5009.22—1996，GB/T 17480—1998）。基于ELISA原理，黄曲霉毒素 ELISA 检测试剂盒得到普遍应用。原理利用固相酶联免疫吸附，将黄曲霉毒素特异性抗体加入到反应孔中，然后再加入样品提取液（未知抗原）及黄曲霉标准品液（已知抗），使两者与抗体之间进行反应，然后加底物进行显色反应，颜色的深浅取决于抗体和酶标AFT抗原结合的量，即样品中黄曲霉毒素的含量，则被抗体结合酶标AFT 抗体结合酶标AFT抗原越少，颜色越浅，反之则深。原理如图1所示。
称取20g经粉碎过的样品于三角瓶中，滴加约6mL水，使样品湿润，准确加入60mL三氯甲烷，摇床振荡30min，加入12g无水硫酸钠，振摇均匀后，静置30min，然后过滤于250mL三角瓶中。用移液枪准确移取12mL滤液到蒸发皿中，然后放在65℃水浴锅上，挥干之后加入1mL苯-乙腈的混合液，混匀，若此时有苯的晶体析出，取出，继续溶解、混合，晶体若消失，就用移液枪吸取上清液到2mL离心管中。
1 引言 1
1.1 黄曲霉毒素的检测 1
1.1.1 黄曲霉毒素的性质介绍 1
1.1.2 黄曲霉毒素的检测方法 2
1.1.2.1 薄层层析法（TLC法） 2
1.1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA） 2
1.1.2.3 Charm ROSA试剂条法 3
1.1.2.4 微柱法 3
1.1.2.5 高效液相色谱法（HPLC） 3
1.1.3 小结 4
2 材料与方法 4
2.1 薄层色谱法定性检测黄曲霉毒素B1 4
2.1.1 实验材料 4
2.1.1.1 药品与试剂 4
2.1.1.2 实验样品 4
2.1.1.3 溶液配置 4
2.1.2 薄层色谱法的定性检测原理 5
2.1.3 实验方法 5
2.1.3.1 样品的提取 5
2.1.3.2 操作步骤 5
2.2 酶联免疫吸附法定量检测黄曲霉毒素B1 6
2.2.1 实验材料 6
2.2.1.1 药品与仪器 6
2.2.1.2 溶液配置 6
2.2.1.3 酶联分析步骤 6
2.2.1.4 酶标板的最适甲醇浓度的测试 7
2.2.1.5 多种样品的定量检测 7
2.3 Charm ROSA试剂条法定量黄曲霉毒素B1 7
2.3.1 实验材料 7
2.3.1.1 实验样品及试剂 7
2.3.1.2 样品处理流程 7
2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
.3.1.3 检测步骤 7
3 结果分析 8
3.1 薄层层析方法结果分析 8
3.1.1 最低检出量的测定 8
3.2 酶联免疫吸附法的结果分析 8
3.2.1 黄曲霉标准曲线绘制 8
3.2.2 酶标板的最适检测液-甲醇浓度的测试 9
3.2.3 多种样品的检测结果 9
3.3 试剂条法的结果分析 9
4 讨论 10
结 论 12
致 谢 13
参 考 文 献 14
1 引言
黄曲霉毒素是一种毒性和继发曲霉菌和曲霉菌产生的代谢产物。在世界的不同地方，食品安全问题已成为食品的一个热点，它是在供人类消费的食物中发现的。自上世纪60年代以来，黄曲霉毒素的危害主要是黄曲霉毒素的报道，这已成为一种毒素在大多数人的关注。其中黄曲霉毒素B1污染的物质，广泛存在于谷物和饲料及其加工产品在目前已知的200种霉菌毒素中毒性最强，最高频率的污染。
目前，黄曲霉毒素B1的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法和酶联法等。这些方法因受实验本身的限制，精确度低；样品前处理过程复杂，浪费时间；检测设备仪器价格昂贵，难以推广，导致饲料中的黄曲霉毒素无法被准确的检测出来。因此，对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析时，使用准确、快速、简便的方法，是研究黄曲霉毒素的一个重要方面。
1.1 黄曲霉毒素的检测
1.1.1 黄曲霉毒素的性质介绍
迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等17种结构相似且特征已知的化合物。黄曲霉是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，无色无味，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，前者为基本结构，后者与致癌有关。
表1 我国对黄曲霉毒素B1在各种食品和饲料中含量限量标准
产品名称 限量标准(μg/kg) 试验方法
黄曲霉毒素B1允许量(μg/kg) 花生、花生仁、花生油 ≤20 GB/T17480或GB/T8381
玉米及其制品 ≤20
大米及其他食用植物油 ≤10
其他粮食、豆类及发酵类食品 ≤5
酱油、醋等调味品 ≤5
婴儿代乳食品 不得检出
黄曲霉毒素的理化性质比较稳定，如B1在高温200℃、紫外线照射下，都不能使之破坏，加热到B1的熔点（268-269℃）才开始分解；易溶于甲醇、二甲基甲酰胺、氯仿，难溶于己烷、石油醚等；在酸性溶液中，黄曲霉毒素B1也很稳定，在PH 1—3的强酸性溶液中则稍有分解[1]。黄曲霉毒素的毒性是氰化钾毒性的10倍，是砒霜的68倍，与人的肝癌有密切关系，能使家畜、家禽及多种实验动物诱发癌症，其中B1、B2、G1、G2的毒性比较大，而B1是迄今发现的各种真菌毒素中化学性质最稳定的一种[2,3]。
1.1.2 黄曲霉毒素的检测方法
黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，新的化学检测手段和新仪器的出现，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求[4]。
1.1.2.1 薄层层析法（TLC法）
薄层层析法是传统的检测黄曲霉毒素常用方法。该方法原理是：样品经提取、浓缩、薄层分离后，在紫外光照射下（波长365nm），黄曲霉毒素显示紫色荧光。根据其所显示荧光的最低量来检测出试样中黄曲霉毒素的含量，属于定性和半定量分析方法。其优点是试验设备简单低廉，操作方法简单易行，容易操作。目前我国检测各类粮食食品级饲料主要应用此方法，所有旧版国家标准都是依据此原理设计的检验方法。但是近年的研究工作主要集中在改进样品样品的提取和净化方法，改善薄层色谱条件和分离方法。样品前处理较繁琐，而且不能准确定量分析。
1.1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）
ELISA方法是20世纪70年代来发展起来的一种新的分析方法，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定性或定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原。我国也有以ELISA检测食品及饲料中AFB1的研究报道。酶联免疫吸附分析法也成为我国检测食品和饲料中 AFB1含量的标准方法（GB/T 5009.22—1996，GB/T 17480—1998）。基于ELISA原理，黄曲霉毒素 ELISA 检测试剂盒得到普遍应用。原理利用固相酶联免疫吸附，将黄曲霉毒素特异性抗体加入到反应孔中，然后再加入样品提取液（未知抗原）及黄曲霉标准品液（已知抗），使两者与抗体之间进行反应，然后加底物进行显色反应，颜色的深浅取决于抗体和酶标AFT抗原结合的量，即样品中黄曲霉毒素的含量，则被抗体结合酶标AFT 抗体结合酶标AFT抗原越少，颜色越浅，反之则深。原理如图1所示。
称取20g经粉碎过的样品于三角瓶中，滴加约6mL水，使样品湿润，准确加入60mL三氯甲烷，摇床振荡30min，加入12g无水硫酸钠，振摇均匀后，静置30min，然后过滤于250mL三角瓶中。用移液枪准确移取12mL滤液到蒸发皿中，然后放在65℃水浴锅上，挥干之后加入1mL苯-乙腈的混合液，混匀，若此时有苯的晶体析出，取出，继续溶解、混合，晶体若消失，就用移液枪吸取上清液到2mL离心管中。
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