c.saccharolyticus耐高温纤维素酶cel74的高效表达与性质研究(附件)
木质纤维素是人类可利用到的生物圈中最丰富的天然可再生有机物质，储量占到植物界碳素总量的一半以上，并且具有可再生、廉价丰富、绿色清洁等优点而备受关注。而耐热纤维素酶不仅能够水解木质纤维素将其转化为可溶性的单糖和寡糖，还具有良好的热稳定性，适合工业化生产。本实验所研究的耐热纤维素酶Cel74，来源于极端嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis，它所产生的纤维素酶可以降解天然木质纤维素，该酶中的其中一种双催化结构域纤维素酶是CkXgl74A/Cel48A，它具有N端的糖苷水解酶74家族（Glycoside hydrolase 74 families，GH74）催化结构域，本实验主要针对这种截短蛋白酶进行研究，并表征其酶学性质。本实验将采用无缝克隆手段，以木葡聚糖酶GH74基因组为模板，通过无缝克隆pcr引物设计的方法扩增得到目的基因。该目的基因经双酶切处理后连接到大肠杆菌Escherichia coli DH5a中，验证得到正确的表达载体，随后转化到E. coli BL21（DE3），使之在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达。最后经过对GH74的酶学性质测定，可知该重组酶的最适pH为7.5，且其在pH 5.5时稳定性较高，在pH 5.0-7.5情况下37℃保温2 h能够保持75%以上的酶活力，这一结果表明其具有一定的耐酸能力。与此同时，经测定该酶的最适反应温度为80℃，而在50℃保温2h的情况下能保持80%以上的酶活力，因此该重组酶也具有一定的温度稳定性。关键词纤维素，纤维素酶，热稳定性，分子克隆，基因表达
目 录
1 引言 2
1.1 能源现状 2
1.2 木质纤维素 2
1.3 纤维素酶 3
1.4 耐热纤维素酶 4
1.5 纤维素酶基因的相关表达宿主 4
2 实验材料与实验方法 5
2.1 实验材料 5
2.2 实验方法 11
3 酶学性质表征 20
3.1 蛋白质电泳 20
3.2 酶学性质测定方法 20
4 重组酶的纯化结果 23
结 论 26
致 谢 27
参 考 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
文 献 28
1 引言
1.1 能源现状
能源是人类赖以生存的物质基础，与此同时人类文明城市的建设与经济文化的发展也离不开能源的消耗，因此能源问题也逐渐成为了各国议程上需要全球合作解决的首要问题。在过去，人类所能够发现以及利用的能源十分有限，以传统能源为主，例如煤炭石油、天然气等。进入20世纪的后工业时代，能源危机在全世界范围内初现端倪，据国际能源机构的数据显示，如果目前的煤炭使用速度仍然不可控，人类开采将大大减少煤炭和石油和天然气在地球上的使用寿命。21世纪，世界工业发展得越来越快。能源问题已经不仅仅是某一个国家的问题，而成为了整个世界，乃至整个人类社会所要面对和所要解决的问题。
我国拥有丰富的煤炭石油储备，是能源的生产大国。自1990年煤炭石油开采技术发展以来，我国就在能源生产总量方面名列前茅，但同时作为发展中国家，我国对能源的消耗量也非常可观，目前的人均占有的能源量只有发达国家的5%10%，再加上我国使用能源设备的技术革新速度慢、效率偏低，导致造成巨大的能源浪费[1]。除此之外，目前为止我国的能源生产与消费的主要框架结构也是以煤炭和石油为基础的，长期下去由此造成的严重环境污染后果也无法估量[2]。
如今，地球上不可再生资源经过数十年的集中开采后已经日趋匮乏，而作为发展中国家的中国对进口石油仍保持着过度依赖的状态，这些严峻问题使我们不得不面对严肃对待全球能源安全问题，尤其是目前全球石油价格飞涨，各国之间对能源资源的争夺日益激烈，与人类生活息息相关的能源问题已成为关系到国民经济和民生以及整个国家经济可持续发展的关键问题。在这种传统能源资源日趋枯竭的情况之下，寻找新能源便成为我国能源发展的当务之急。
1.2 木质纤维素
近年来，随着全世界的石化资源短缺和环境恶化，寻找清洁、可持续的传统能源代替资源已成为社会关注热点。木质纤维素（lignocellulose）作为人类可利用到的生物圈中最丰富的天然可再生有机物质，据粗略估计木质纤维素原料的储量能够占到植物界碳素总量的一半以上，并且具有可再生、廉价丰富、绿色清洁等优点而备受关注。
木质纤维素具有非常广泛的来源，如①农业废弃物，包括玉米芯、稻草、树木、各类农作物秸秆等；②工业废弃物，包括服装生产后的废料纤维渣等；③城市废弃物，包括商店用包装纸、纸盒等；④林业废弃物[34]。这些废弃物收集过后经一些物理化学方法的预处理操作，可以获得清洁和无污染的有机絮状纤维，再经过降解可将生物质转化为还原糖，并利用水解生成的糖进一步发酵来制取酒精、糠醛等高附加值的化工原料。因此，作为木质纤维素主要化学成分的纤维素，其生产应用范围十分广泛，遍及制浆造纸工业、纺织工业、纤维化工和生物质能源工业[5]。
但一直以来，木质纤维素都没有得到有效的利用与开发，这与它致密的纤维素结构有关。木质纤维素主要是由结晶纤维素构成，而结晶纤维素结构致密可形成天然屏障，不容易被水解[6]。
构成结晶纤维素的纤维素链是由无数个葡萄糖单元通过β14糖苷键连接而成，这些葡萄糖单元上存在数个羟基，因此导致在纤维素链内和纤维素链之间存在着大量的氢键，于是就形成了整齐致密的结构。这种致密结构导致水、纤维素酶和化学试剂根本无法进入到纤维素内部。因此即使再多的纤维素酶和再高的活性，都将很难起到降解作用。
除了要攻克纤维质原料内部网状结构破坏使之变得松散易降解的难题以外，在工业生产中，人们还会对纤维素进行预处理，预处理的条件则会使纤维素处于一种高温、酸性的环境中，然而酶的反应条件一般比较温和，在高温下会使酶活力下降，甚至是失活，所以构建一种可以在高温下仍具有高效酶活的纤维素酶，是许多研究者的目标。
1.3 纤维素酶
纤维素酶(cellulase)是酶的一种，在分解纤维素的时候通过一系列水解作用断裂β1,4葡萄糖苷键，将纤维素转化为可溶性糖和葡萄糖。但Cellulase不是单体酶，而是协同多组分酶系统，除了高活性木聚糖酶外，主要由β1,4内切葡聚糖酶（也称为羧甲基纤维素酶）、β1,4外切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶组成[7]。纤维素酶是由微生物合成的诱导酶，几种类型的微生物可以产生纤维素酶，包括真菌、放线菌和细菌。但产纤维素酶的细菌种类有限，曾报道过的菌种主要有芽孢杆菌、纤维素单胞菌、交替单胞菌、热纤梭菌和醋弧菌属等；而产纤维素酶的真菌非常普遍，典型的曲霉(曲霉)、青霉(青霉)和Trichoderma(木霉)。而本实验选取的是解糖热解纤维素菌属Caldicellulosiruptor kronotskyensis的菌株，因其生长速度通常比真菌的高，且表现出了更好的温度稳定性，这使得基因工作更容易进行。
目 录
1 引言 2
1.1 能源现状 2
1.2 木质纤维素 2
1.3 纤维素酶 3
1.4 耐热纤维素酶 4
1.5 纤维素酶基因的相关表达宿主 4
2 实验材料与实验方法 5
2.1 实验材料 5
2.2 实验方法 11
3 酶学性质表征 20
3.1 蛋白质电泳 20
3.2 酶学性质测定方法 20
4 重组酶的纯化结果 23
结 论 26
致 谢 27
参 考 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
文 献 28
1 引言
1.1 能源现状
能源是人类赖以生存的物质基础，与此同时人类文明城市的建设与经济文化的发展也离不开能源的消耗，因此能源问题也逐渐成为了各国议程上需要全球合作解决的首要问题。在过去，人类所能够发现以及利用的能源十分有限，以传统能源为主，例如煤炭石油、天然气等。进入20世纪的后工业时代，能源危机在全世界范围内初现端倪，据国际能源机构的数据显示，如果目前的煤炭使用速度仍然不可控，人类开采将大大减少煤炭和石油和天然气在地球上的使用寿命。21世纪，世界工业发展得越来越快。能源问题已经不仅仅是某一个国家的问题，而成为了整个世界，乃至整个人类社会所要面对和所要解决的问题。
我国拥有丰富的煤炭石油储备，是能源的生产大国。自1990年煤炭石油开采技术发展以来，我国就在能源生产总量方面名列前茅，但同时作为发展中国家，我国对能源的消耗量也非常可观，目前的人均占有的能源量只有发达国家的5%10%，再加上我国使用能源设备的技术革新速度慢、效率偏低，导致造成巨大的能源浪费[1]。除此之外，目前为止我国的能源生产与消费的主要框架结构也是以煤炭和石油为基础的，长期下去由此造成的严重环境污染后果也无法估量[2]。
如今，地球上不可再生资源经过数十年的集中开采后已经日趋匮乏，而作为发展中国家的中国对进口石油仍保持着过度依赖的状态，这些严峻问题使我们不得不面对严肃对待全球能源安全问题，尤其是目前全球石油价格飞涨，各国之间对能源资源的争夺日益激烈，与人类生活息息相关的能源问题已成为关系到国民经济和民生以及整个国家经济可持续发展的关键问题。在这种传统能源资源日趋枯竭的情况之下，寻找新能源便成为我国能源发展的当务之急。
1.2 木质纤维素
近年来，随着全世界的石化资源短缺和环境恶化，寻找清洁、可持续的传统能源代替资源已成为社会关注热点。木质纤维素（lignocellulose）作为人类可利用到的生物圈中最丰富的天然可再生有机物质，据粗略估计木质纤维素原料的储量能够占到植物界碳素总量的一半以上，并且具有可再生、廉价丰富、绿色清洁等优点而备受关注。
木质纤维素具有非常广泛的来源，如①农业废弃物，包括玉米芯、稻草、树木、各类农作物秸秆等；②工业废弃物，包括服装生产后的废料纤维渣等；③城市废弃物，包括商店用包装纸、纸盒等；④林业废弃物[34]。这些废弃物收集过后经一些物理化学方法的预处理操作，可以获得清洁和无污染的有机絮状纤维，再经过降解可将生物质转化为还原糖，并利用水解生成的糖进一步发酵来制取酒精、糠醛等高附加值的化工原料。因此，作为木质纤维素主要化学成分的纤维素，其生产应用范围十分广泛，遍及制浆造纸工业、纺织工业、纤维化工和生物质能源工业[5]。
但一直以来，木质纤维素都没有得到有效的利用与开发，这与它致密的纤维素结构有关。木质纤维素主要是由结晶纤维素构成，而结晶纤维素结构致密可形成天然屏障，不容易被水解[6]。
构成结晶纤维素的纤维素链是由无数个葡萄糖单元通过β14糖苷键连接而成，这些葡萄糖单元上存在数个羟基，因此导致在纤维素链内和纤维素链之间存在着大量的氢键，于是就形成了整齐致密的结构。这种致密结构导致水、纤维素酶和化学试剂根本无法进入到纤维素内部。因此即使再多的纤维素酶和再高的活性，都将很难起到降解作用。
除了要攻克纤维质原料内部网状结构破坏使之变得松散易降解的难题以外，在工业生产中，人们还会对纤维素进行预处理，预处理的条件则会使纤维素处于一种高温、酸性的环境中，然而酶的反应条件一般比较温和，在高温下会使酶活力下降，甚至是失活，所以构建一种可以在高温下仍具有高效酶活的纤维素酶，是许多研究者的目标。
1.3 纤维素酶
纤维素酶(cellulase)是酶的一种，在分解纤维素的时候通过一系列水解作用断裂β1,4葡萄糖苷键，将纤维素转化为可溶性糖和葡萄糖。但Cellulase不是单体酶，而是协同多组分酶系统，除了高活性木聚糖酶外，主要由β1,4内切葡聚糖酶（也称为羧甲基纤维素酶）、β1,4外切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶组成[7]。纤维素酶是由微生物合成的诱导酶，几种类型的微生物可以产生纤维素酶，包括真菌、放线菌和细菌。但产纤维素酶的细菌种类有限，曾报道过的菌种主要有芽孢杆菌、纤维素单胞菌、交替单胞菌、热纤梭菌和醋弧菌属等；而产纤维素酶的真菌非常普遍，典型的曲霉(曲霉)、青霉(青霉)和Trichoderma(木霉)。而本实验选取的是解糖热解纤维素菌属Caldicellulosiruptor kronotskyensis的菌株，因其生长速度通常比真菌的高，且表现出了更好的温度稳定性，这使得基因工作更容易进行。
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