产纤维素酶菌株的筛选鉴定及酶学性质研究
采用CMC-Na为唯一碳源的培养基，从泥土中分离筛选产纤维素酶菌株，并对酶活最高的菌株进行菌种鉴定和其酶学性质的初步研究。通过初筛和复筛得到酶活较高的产纤维素酶菌株T15。通过形态学、生理生化鉴定以及分子鉴定分析，该菌为革兰氏阳性的芽孢杆菌。对芽孢杆菌T15产生的纤维素酶进行酶学性质的初探，结果表明该菌株中羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶以及滤纸酶的最适作用温度分别为65℃、50℃、60℃，最适作用pH分别为6.0、5.0、6.5。关键词 芽孢杆菌，分离筛选，菌种鉴定，酶学性质，
目 录
1 绪论 1
1.1 纤维素概述 1
1.2 纤维素酶 2
1.3 选题依据和研究内容 4
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.2 实验方法 7
3 结果与讨论 11
3.1 产纤维素酶菌株的筛选 11
3.2 菌株形态学特征及生理生化鉴定 13
3.3 分子鉴定 13
3.4 菌株产纤维素酶酶学性质研究 14
结论...18
致谢...19
参考文献...20
1 绪论
1.1 纤维素概述
1.1.1 纤维素资源
纤维素是地球上含量最多的碳水化合物，在世界上分布非常广泛，它作为植物细胞壁的重要组成成分大约占植物干重的35%50%，与此同时它是自然界中非常丰富并且用之不竭可再生资源，很多国家用来解决环境和能源问题的方案之一将木质纤维素材料作原料生产第二代生物燃料。全世界陆地植物每年能够产生约1.3×1010吨植物生物质，释放的总能量约为7×109吨煤，占到了全世界所消耗的总能量的三分之二[1]。与此同时，工业生产和林业、城市建设过中产生的纤维素废物数量也非常多。
1.1.2 纤维素的组成与结构
纤维素、半纤维素和木质素三种聚合物主要以杂合矩阵的形式相互交联，进而构成了木质纤维素物质。生物质的类型决定了三种聚合物相对丰度变化[2]。木质纤维素类物质除了含有以上三种聚合物外，还包括一些蛋白质、脂肪、几丁质、可溶性糖以及矿物质等成分。< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
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图1 纤维素的化学结构
高等植物的细胞壁主要成分之一就是纤维素,毗喃型D葡萄糖残基以β1,4糖苷键相连接而构成了纤维素分子这种有着复杂结构的结晶分子。纤维素分子有着较大的聚合度范围，一般情况下是800010000个葡萄糖残基，它们的不同因为植物的来源品种各不相同 [3]。结晶分子先构成直链状的分子以基本单元的形式，然后这些大分子通过折叠的方式组成了具备高结晶度的纤维素基本单位，这些基本单位又高度集中在一起构成微小的结构单位，最后自然界不同类型、长度、大小的纤维素都是由这些微小的结构单位组成。氢键的结合作用形成了纤维素链之间的纤维素束，这些纤维素在密度大的地方平行排列，构成了纤维素的结晶区；而它们在密度小的地方定向变差，构成了纤维素的无定形区。纤维素结构复杂且密度大，尤其是结晶纤维素，事先应用化学或机械方法进行处理，才可以较为容易被水解 [4]。
1.2 纤维素酶
1.2.1 纤维素酶的来源
昆虫、软体动物以及真菌、细菌与放线菌等微生物的代谢产物中都含有一定的纤维素酶，工业上主要利用微生物发酵来产生纤维素酶[5]。
真菌分泌的纤维素酶具有酶系较全以及活性较强的优点，但木霉等一些霉菌在培养过程中会有菌丝蔓延，产生酸败霉腐气味的现象，而且往往伴随着一定的毒性，而最大的负面影响是，利用真菌类来进行发酵所消耗的周期通常比较长，因而在工业生产中的应用比如食品酿造和饲料发酵方面有着比较大的限制。另外一种是来源于细菌的纤维素酶，它们一般是中性或碱性纤维素酶，与真菌分泌的纤维素酶相比，它们包含的酶系较窄、酶活不高，利用它们制成的酶制剂水解天然纤维素能力较弱。但与此同时，分泌纤维素酶的细菌也具有基因结构简单、易培养、易分离纯化、生长pH范围广、培养周期短、易构建基因工程菌等优点，相对于真菌，细菌在研究及应用中具有着霉菌无法相比的优势。纤维弧菌、瘤胃球菌和芽孢杆菌等细菌都能够产生纤维素酶[6]。在这之中，芽抱杆菌因为在自然界中普遍存在、而且具有高产芽孢的能力、较强的抗逆性、并且能够分泌自然界中多种酶类和容易分离进而培养等一系列优点，因而受到了科研人员的青睐，目前对这类细菌纤维素酶高产菌株的筛选是一个较为热门研究点。在这其中，枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中最具代表性的，科学界对其生产纤维素酶有着很高的研究热情[7]。
1.2.2 纤维素酶的组成与分类
纤维素酶是用来降解纤维素的酶的总称，而不是仅仅指的是一种单一的酶。多种水解酶组成了纤维素酶这种复杂的酶系[8]。一般情况，纤维素酶被分成三大类，具体分类如下：
第一种是内切葡聚糖酶，纤维素非结晶区糖链内部的糖苷键能够被内切葡聚糖酶随机地酶切，在这个过程中多个不同长短的寡糖链片段被制造了出来；
第二种是外切葡聚糖酶，包含了1，4βDglucan glucanohydrolase和1，4βD葡聚糖纤维二糖水解酶这两种酶，它从纤维素糖链的还原末端或非还原末端开始作用以前进型的方式，葡萄糖或纤维二糖在酶切的过程中释放了出来。同时，微晶纤维素还能够受到这种酶的作用，分析推测它起作用的方式应为将纤维素链从微晶纤维素上剥离出来；
第三种是β葡萄糖苷酶，β葡萄糖苷酶能够将纤维糊精和纤维二糖通过分解成为葡萄糖[9]。
1.2.3 纤维素酶的性质
纤维素酶不同于其它一些不稳定的酶，它既可直接利用粗酶来进行酶学性质的研究，也能够通过盐析、透析、羧基磷灰石柱、葡聚糖凝胶SephadexG75、SephadexG100、SephadexG200等，离子交换剂DEAEBioGel A、DEAESephadex A和苯基交联琼脂糖Agarose 4B等一系列纯化方式后再进行同样的酶学性质研究[10]。细菌所产纤维素酶一般为中性或碱性，酶的最适反应pH在pH7.0pH10.0之间，而稳定pH为3.013.0之间，最适反应温度在40℃60℃之间，分子量大多数在100kD左右，也有的在500kD或180kD左右，等电点在3.04.4附近，金属离子Hg2+、Co2+、Cu2+等对酶活力有不同的影响，CMCNa对多数碱性纤维素酶具有诱导作用，而葡萄糖则会明显抑制酶合成。
目 录
1 绪论 1
1.1 纤维素概述 1
1.2 纤维素酶 2
1.3 选题依据和研究内容 4
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.2 实验方法 7
3 结果与讨论 11
3.1 产纤维素酶菌株的筛选 11
3.2 菌株形态学特征及生理生化鉴定 13
3.3 分子鉴定 13
3.4 菌株产纤维素酶酶学性质研究 14
结论...18
致谢...19
参考文献...20
1 绪论
1.1 纤维素概述
1.1.1 纤维素资源
纤维素是地球上含量最多的碳水化合物，在世界上分布非常广泛，它作为植物细胞壁的重要组成成分大约占植物干重的35%50%，与此同时它是自然界中非常丰富并且用之不竭可再生资源，很多国家用来解决环境和能源问题的方案之一将木质纤维素材料作原料生产第二代生物燃料。全世界陆地植物每年能够产生约1.3×1010吨植物生物质，释放的总能量约为7×109吨煤，占到了全世界所消耗的总能量的三分之二[1]。与此同时，工业生产和林业、城市建设过中产生的纤维素废物数量也非常多。
1.1.2 纤维素的组成与结构
纤维素、半纤维素和木质素三种聚合物主要以杂合矩阵的形式相互交联，进而构成了木质纤维素物质。生物质的类型决定了三种聚合物相对丰度变化[2]。木质纤维素类物质除了含有以上三种聚合物外，还包括一些蛋白质、脂肪、几丁质、可溶性糖以及矿物质等成分。< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
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图1 纤维素的化学结构
高等植物的细胞壁主要成分之一就是纤维素,毗喃型D葡萄糖残基以β1,4糖苷键相连接而构成了纤维素分子这种有着复杂结构的结晶分子。纤维素分子有着较大的聚合度范围，一般情况下是800010000个葡萄糖残基，它们的不同因为植物的来源品种各不相同 [3]。结晶分子先构成直链状的分子以基本单元的形式，然后这些大分子通过折叠的方式组成了具备高结晶度的纤维素基本单位，这些基本单位又高度集中在一起构成微小的结构单位，最后自然界不同类型、长度、大小的纤维素都是由这些微小的结构单位组成。氢键的结合作用形成了纤维素链之间的纤维素束，这些纤维素在密度大的地方平行排列，构成了纤维素的结晶区；而它们在密度小的地方定向变差，构成了纤维素的无定形区。纤维素结构复杂且密度大，尤其是结晶纤维素，事先应用化学或机械方法进行处理，才可以较为容易被水解 [4]。
1.2 纤维素酶
1.2.1 纤维素酶的来源
昆虫、软体动物以及真菌、细菌与放线菌等微生物的代谢产物中都含有一定的纤维素酶，工业上主要利用微生物发酵来产生纤维素酶[5]。
真菌分泌的纤维素酶具有酶系较全以及活性较强的优点，但木霉等一些霉菌在培养过程中会有菌丝蔓延，产生酸败霉腐气味的现象，而且往往伴随着一定的毒性，而最大的负面影响是，利用真菌类来进行发酵所消耗的周期通常比较长，因而在工业生产中的应用比如食品酿造和饲料发酵方面有着比较大的限制。另外一种是来源于细菌的纤维素酶，它们一般是中性或碱性纤维素酶，与真菌分泌的纤维素酶相比，它们包含的酶系较窄、酶活不高，利用它们制成的酶制剂水解天然纤维素能力较弱。但与此同时，分泌纤维素酶的细菌也具有基因结构简单、易培养、易分离纯化、生长pH范围广、培养周期短、易构建基因工程菌等优点，相对于真菌，细菌在研究及应用中具有着霉菌无法相比的优势。纤维弧菌、瘤胃球菌和芽孢杆菌等细菌都能够产生纤维素酶[6]。在这之中，芽抱杆菌因为在自然界中普遍存在、而且具有高产芽孢的能力、较强的抗逆性、并且能够分泌自然界中多种酶类和容易分离进而培养等一系列优点，因而受到了科研人员的青睐，目前对这类细菌纤维素酶高产菌株的筛选是一个较为热门研究点。在这其中，枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中最具代表性的，科学界对其生产纤维素酶有着很高的研究热情[7]。
1.2.2 纤维素酶的组成与分类
纤维素酶是用来降解纤维素的酶的总称，而不是仅仅指的是一种单一的酶。多种水解酶组成了纤维素酶这种复杂的酶系[8]。一般情况，纤维素酶被分成三大类，具体分类如下：
第一种是内切葡聚糖酶，纤维素非结晶区糖链内部的糖苷键能够被内切葡聚糖酶随机地酶切，在这个过程中多个不同长短的寡糖链片段被制造了出来；
第二种是外切葡聚糖酶，包含了1，4βDglucan glucanohydrolase和1，4βD葡聚糖纤维二糖水解酶这两种酶，它从纤维素糖链的还原末端或非还原末端开始作用以前进型的方式，葡萄糖或纤维二糖在酶切的过程中释放了出来。同时，微晶纤维素还能够受到这种酶的作用，分析推测它起作用的方式应为将纤维素链从微晶纤维素上剥离出来；
第三种是β葡萄糖苷酶，β葡萄糖苷酶能够将纤维糊精和纤维二糖通过分解成为葡萄糖[9]。
1.2.3 纤维素酶的性质
纤维素酶不同于其它一些不稳定的酶，它既可直接利用粗酶来进行酶学性质的研究，也能够通过盐析、透析、羧基磷灰石柱、葡聚糖凝胶SephadexG75、SephadexG100、SephadexG200等，离子交换剂DEAEBioGel A、DEAESephadex A和苯基交联琼脂糖Agarose 4B等一系列纯化方式后再进行同样的酶学性质研究[10]。细菌所产纤维素酶一般为中性或碱性，酶的最适反应pH在pH7.0pH10.0之间，而稳定pH为3.013.0之间，最适反应温度在40℃60℃之间，分子量大多数在100kD左右，也有的在500kD或180kD左右，等电点在3.04.4附近，金属离子Hg2+、Co2+、Cu2+等对酶活力有不同的影响，CMCNa对多数碱性纤维素酶具有诱导作用，而葡萄糖则会明显抑制酶合成。
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