无差别扩增在单细胞文库构建中的应用
摘要：高通量测序技术极大的推动了全基因组测序的发展. 全基因组序列分析的通常需要大量的基因组DNA，然而很多时候我们只有少量的供检测的细胞样本，尤其是来源于病人样本的少量原代细胞。必需通过DNA扩增才能获得大量的可用于基因组测序的DNA。单细胞基因组的无差别扩增技术的发展为单细胞基因组分析提供了可能。单细胞无差别扩增可从少量甚至单个细胞中通过无差别扩增反应得到大量可用于高通量测序的基因组DNA[8]。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料4
1.2 仪器与设备4
1.3 实验试剂配制5
1.4实验方法6
1.4.1 获取单细胞6
1.4.2 准备Buffer D6
1.4.3 裂解细胞反应6
1.4.4 中和反应体系7
1.4.5 准备反应混合液7
1.4.6 PCR反应7
1.4.7 终止反应7
1.4.8 构建基因文库7
1.4.9 测序9
2 结果与分析9
2.1 单细胞扩增产物电泳结果 9
2.2 全基因组扩增产物均一度与覆盖度检 10
2.3 以单个细胞为起始模板的扩增产物积累曲线10
2.4 以10 ng纯化基因组DNA为起始模板的扩增产物积累曲线11
2.5 单细胞文库构建2100分析图11
2.6 测序信息图表12
3 讨论13
致谢13
参考文献13
无差别扩增在单细胞文库构建中的应用
引言
引言
单细胞测序有着广泛的应用前景，比如产前诊断，基因筛查，肿瘤干细胞分析以及生物体早期发育研究。单细胞测序可以将诊断和研究提高到单个细胞的水平，能精确的把握单个细胞的命运，但单细胞测序也面临着前所未有的困难，首先单细胞获取相对困难，需要显微操作等辅助工具，其次单细胞所能提供的样本量非常少，远低于全基因组测序所要求的基因组DNA的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
量。这就需要先对基因组进行扩增，但是大家所熟知的PCR扩增会明显引入扩增差异，有些片段被大量扩增但有些片段却在扩增中丢失，这将对全基因组测序的覆盖度产生很大的负面影响[1]。
基于MDA的Phi29等温扩增体系，为单细胞测序提供了可能。Phi29 DNA聚合酶是从噬菌体中克隆的DNA聚合酶，具有很强的链置换活性，可以实现对DNA复杂结构解链与复制。同时这种非常强的链置换活性也保证了Phi29 DNA聚合酶可以在体外进行不依赖于热循环的恒温DNA聚合反应[2]。并且Phi29 DNA聚合酶具有很强的链亲合力，单次聚合反应可以实现长达100 kb的连续聚合延伸，使扩增产物适用于几乎所有下游基因组分析。正常情况下的反应可以产生3040 μg高覆盖度的全基因组DNA，低质量的样品会影响最终的DNA产量，应尽量避免使用大量降解和片段化的DNA作为起始样本[12]。
1 材料与方法
1.1实验材料
Phi29 DNA Polymerase来源NEB，产品全称Phi29 DNA Polymerase。此酶是从Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆的DNA聚合酶(10U/微升)
VAHTSTM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina?购于Vazyme公司，是针对Illumina高通量测序平台文库构建定向优化的试剂盒
AMPure? XP Beads、80%乙醇
DTT、PBS、NaOH、KCl、HCl、EDTA、Tris、Tween? 20 、IGEPAL? CA630
1.2仪器与设备
WH1微型漩涡混合仪
上海沪西分析仪器厂
SWCJ1FD超净工作台
苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
XO8D数显恒温三温水浴锅
南京先欧仪器制造有限公司
SPTPA系列智能生化培养箱
Darthcarter
稳压稳流电泳仪
Cavoy
YP6102电子天平
上海光正医疗仪器有限公司
GenoSens 1850凝胶图像分析系统
CLiNX Science Instruments公司
退火温度梯度PCR仪
ExCell Bio公司
2720型 PCR仪
Applied Biosystems公司
THZD摇床
苏州培英实验设备有限公司
FRESCO 17离心机
Thermo scientific公司
磁力架
Biocanal Scientific
倒置显微镜
瑞典Amersham Biosciences公司
移液枪
RAININ
3 实验试剂配制
①50×TAE贮存液
取 Tris 碱 242 g，冰乙酸 57.1 ml，用 0.5mol/L EDTA(pH 8.0) 100 ml 溶解混匀，电泳时加去离子水稀释 50 倍。
②2%和0.07％琼脂糖凝胶
称取 2g （0.07g）琼脂糖，加入 100 ml 1×TAE 电泳缓冲液中，放入微波炉中加热 3 min，取出置室温冷却至 50℃时加入 几滴 EB 储存液。将配好的凝胶液倒入电泳槽中，室温冷却 40 min 后除去挡板，拔掉梳子。
③Phi29 DNA polymerase Storage Buffer[13]:
10 mM TrisHCl
100 mM KCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
50% Glycerol
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料4
1.2 仪器与设备4
1.3 实验试剂配制5
1.4实验方法6
1.4.1 获取单细胞6
1.4.2 准备Buffer D6
1.4.3 裂解细胞反应6
1.4.4 中和反应体系7
1.4.5 准备反应混合液7
1.4.6 PCR反应7
1.4.7 终止反应7
1.4.8 构建基因文库7
1.4.9 测序9
2 结果与分析9
2.1 单细胞扩增产物电泳结果 9
2.2 全基因组扩增产物均一度与覆盖度检 10
2.3 以单个细胞为起始模板的扩增产物积累曲线10
2.4 以10 ng纯化基因组DNA为起始模板的扩增产物积累曲线11
2.5 单细胞文库构建2100分析图11
2.6 测序信息图表12
3 讨论13
致谢13
参考文献13
无差别扩增在单细胞文库构建中的应用
引言
引言
单细胞测序有着广泛的应用前景，比如产前诊断，基因筛查，肿瘤干细胞分析以及生物体早期发育研究。单细胞测序可以将诊断和研究提高到单个细胞的水平，能精确的把握单个细胞的命运，但单细胞测序也面临着前所未有的困难，首先单细胞获取相对困难，需要显微操作等辅助工具，其次单细胞所能提供的样本量非常少，远低于全基因组测序所要求的基因组DNA的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
量。这就需要先对基因组进行扩增，但是大家所熟知的PCR扩增会明显引入扩增差异，有些片段被大量扩增但有些片段却在扩增中丢失，这将对全基因组测序的覆盖度产生很大的负面影响[1]。
基于MDA的Phi29等温扩增体系，为单细胞测序提供了可能。Phi29 DNA聚合酶是从噬菌体中克隆的DNA聚合酶，具有很强的链置换活性，可以实现对DNA复杂结构解链与复制。同时这种非常强的链置换活性也保证了Phi29 DNA聚合酶可以在体外进行不依赖于热循环的恒温DNA聚合反应[2]。并且Phi29 DNA聚合酶具有很强的链亲合力，单次聚合反应可以实现长达100 kb的连续聚合延伸，使扩增产物适用于几乎所有下游基因组分析。正常情况下的反应可以产生3040 μg高覆盖度的全基因组DNA，低质量的样品会影响最终的DNA产量，应尽量避免使用大量降解和片段化的DNA作为起始样本[12]。
1 材料与方法
1.1实验材料
Phi29 DNA Polymerase来源NEB，产品全称Phi29 DNA Polymerase。此酶是从Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆的DNA聚合酶(10U/微升)
VAHTSTM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina?购于Vazyme公司，是针对Illumina高通量测序平台文库构建定向优化的试剂盒
AMPure? XP Beads、80%乙醇
DTT、PBS、NaOH、KCl、HCl、EDTA、Tris、Tween? 20 、IGEPAL? CA630
1.2仪器与设备
WH1微型漩涡混合仪
上海沪西分析仪器厂
SWCJ1FD超净工作台
苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
XO8D数显恒温三温水浴锅
南京先欧仪器制造有限公司
SPTPA系列智能生化培养箱
Darthcarter
稳压稳流电泳仪
Cavoy
YP6102电子天平
上海光正医疗仪器有限公司
GenoSens 1850凝胶图像分析系统
CLiNX Science Instruments公司
退火温度梯度PCR仪
ExCell Bio公司
2720型 PCR仪
Applied Biosystems公司
THZD摇床
苏州培英实验设备有限公司
FRESCO 17离心机
Thermo scientific公司
磁力架
Biocanal Scientific
倒置显微镜
瑞典Amersham Biosciences公司
移液枪
RAININ
3 实验试剂配制
①50×TAE贮存液
取 Tris 碱 242 g，冰乙酸 57.1 ml，用 0.5mol/L EDTA(pH 8.0) 100 ml 溶解混匀，电泳时加去离子水稀释 50 倍。
②2%和0.07％琼脂糖凝胶
称取 2g （0.07g）琼脂糖，加入 100 ml 1×TAE 电泳缓冲液中，放入微波炉中加热 3 min，取出置室温冷却至 50℃时加入 几滴 EB 储存液。将配好的凝胶液倒入电泳槽中，室温冷却 40 min 后除去挡板，拔掉梳子。
③Phi29 DNA polymerase Storage Buffer[13]:
10 mM TrisHCl
100 mM KCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
50% Glycerol
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/swgc/701.html
