蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的膜分离工艺研究
蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的膜分离工艺研究[20200509175758]
摘要：本文采用超滤装置对蝙蝠蛾拟青霉发酵液中胞外多糖进行超滤浓缩分离。通过研究操作压力、超滤温度和料液PH值3个工艺参数的单因素实验和多因素正交实验确定超滤浓缩蝙蝠蛾拟青霉发酵液中胞外多糖的最佳工艺参数。研究结果表明：在操作压力0.3MPa，操作温度40℃，料液pH值为6的条件下，用规格为50kD的超滤膜超滤经离心除菌的发酵液为最佳条件。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:蝙蝠蛾拟青霉；胞外多糖；超滤浓缩
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 样品制备 2
1.2.2 发酵液的超滤3
1.2.3 最佳超滤条件的确定 3
1.2.4 超滤膜的清洗 3
2 结果与分析 4
2.1 超滤条件确定 4
2.2 最佳超滤工艺参数的选择 5
2.3 膜的清洗 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的膜分离工艺研究
引言
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis （Berk．） G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel—Jones＆Spatafora），是线虫草科(Ophiocordycipitaeeae)、线虫草属(Ophiocordyceps)的虫生真菌，寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫体上，由虫形菌核(僵虫)和子座 (草部)组成[1]。由于冬具有多种的药理活性，如抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化和提高免疫力等，一直被视为珍贵的中药材而得到广泛的应用。但鉴于天然冬虫夏草对生长 环境要求高，生长率低，加之人们对其需求的日益增加，使得野生的冬虫夏草资源紧缺，其价格甚至比黄金还高。因此，以发酵等方法探索对冬虫夏草进一步开发利用的新途径成为了研究的热点。现代研究表明，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与天然虫草化学组成较为相似，从人体必需的无机元素和微量元素与氨基酸两方面来看，二者差异不大，同时亦含有虫草素和对人体有益的腺甙类、麦角甾醇、甘露醇、多糖类 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
等[2]。蝙蝠蛾拟青霉发酵液含有多种功能性有效成分，如对病菌有抑制作用的虫草菌素、有抗癌作用的虫草多糖和对人体有益的腺苷类、麦角淄醇类、多肽类、D-甘露醇、多糖、有机酸、多胺、磷脂酰胆碱、多种微量元素及维生素、氨基酸、糖、醇类、核苷类及钾、钙等化学成分。目前已从天然虫草及其培养的真菌或发酵液中分离到多种多糖类化合物。现代研究表明，虫草多糖具有多种药理功能：提高机体的免疫功能、保护肝脏、抗辐射、延缓衰老、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、降血脂等。
膜分离技术(membrane separation technique)是一项高效的新分离技术，已被国际公认为20世纪末到21世纪中期最有发展前途的高新生产技术之一。与传统的分离方法相比，膜分离技术具有其独特的优点。膜分离过程没有相变、节能、高效、无二次污染和操作过程比较简单，经济性好，可直接放大，可专一配膜。膜分离技术已广泛应用于中药、食品工业、饮料工业、食品添加剂、植物提取、环保等、生物医药、精细化工、医药化工各个领域[3]。
本试验利用超滤膜分离技术，对蝙蝠蛾拟青霉液态发酵液的多糖进行提取分离，探究蝙蝠蛾拟青霉膜分离技术的优化工艺，为以后冬虫夏草多糖的工业化生产提供理论依据和奠定基础[4]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株
蝙蝠蛾拟青霉菌
1．1．2 培养基配方
斜面培养基成分（g/L）：
发酵培养基成分（g/L）：蔗糖50，酵母浸膏3，(NH4)2SO4 7，MgSO4 0.5，KH2PO4 1.5，麦芽粉 1[5-8]。
1．1．3 仪器
超滤设备（Mini Pellicon，密理博中国有限公司）
数显恒温水浴锅（HH-4型，常州国华电器有限公司）；
台式离心机（TDL-5型，上海安亭科学仪器厂）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A型，上海一恒科技有限公司）；
电子天平（AY-120型、BL-220H型，SHIMADZU）；
722S型可见分光光度计（722S型，上海菁华科技仪器有限公司）；
循环水式真空泵（SHB-Ⅲ型，郑州长城科工贸有限公司）；
pH计（DELTA 320，上海）。
旋涡混匀器（HYQ-2121A型，苏州捷美电子有限公司）；
1．2 实验方法
1．2．1 样品制备
选用斜面培养基配方，将培养基装入试管，放入高压灭菌锅，在121.9℃下，灭菌20min。灭菌结束后趁热摆成斜面。
在超净台上将冷冻保藏的菌种，通过无菌操作接种到斜面培养基中。17℃，无光培养，斜面上菌丝洁白茂密并无杂菌时待用。
将活化培养基上的菌种及时接入液体发酵培养基中，17℃，无光培养168h。
将发酵产物通过抽滤和离心，使菌丝与发酵液分离开来。
1．2．2 发酵液的超滤
1．2．2．1 发酵液的超滤过程
图1超滤流程图
Graph1 Ultrafiltration flow chart
如图1-1所示，把发酵液倒入料液罐中，通过进料泵将料液泵入超滤器，进入超滤膜 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
，截留液流入料液罐中，滤过液流入滤液罐中。通过调节回流阀和料液流速来控制操作压力。
1．2．2．2 膜通量的测定
一定操作压力下，溶液通过超滤膜的透过液为一定体积（V）时所需要的时间（t），用单位时间内通过单位面积（S）的透过量表示：
J=V/(S×t)
式中：J——[L/(m2?h)]；V——透过液体体积，L；S——膜的有效面积，m2；
T——超滤时间，h；
1．2．3 最佳超滤条件的确定
1．2．3．1 超滤膜的选择
在15℃的温度下，分别用两种不同孔径的超滤膜（规格分别为0.1μm和50kD）对发酵液进行超滤，对超滤后的截留液用硫酸苯酚法测总糖含量，来确定最佳超滤膜。
硫酸苯酚法测总糖含量
制作葡萄糖标准曲线。在6支试管中，分别加入配好的0.1mg/ml葡萄糖标准溶液0.0 ml、0.2ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，用纯水将各管液面补到1.0 ml。各管加6%苯酚溶液0.5 ml，再加浓硫酸2.5 ml，混匀并冷却，20 min后于分光光度计490 nm处测吸光值。以葡萄糖微克数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线[9]。
样品中总糖含量测定。配制出适当浓度的待测样品多糖溶液，用移液管取0.1 ml多糖溶液，加0.9 ml纯水，再加0.5ml 6%苯酚溶液、2.5 ml浓硫酸，混匀并冷却，过20 min后测其在490 nm波长的吸光值。
图7 各因素交互作用对膜通量影响的曲面图和等高线
[4] 胡亚芹, 曹杨. 超滤膜技术在多糖提取方面的应用[J]. 生物技术通讯, 2005, 3: 228-230.
[5] 刘欣, 张宗豪, 徐海峰,等. 冬虫夏草茵液体发酵培养基的优化研究[J]. 食用菌, 2013, (1): 14-16
摘要：本文采用超滤装置对蝙蝠蛾拟青霉发酵液中胞外多糖进行超滤浓缩分离。通过研究操作压力、超滤温度和料液PH值3个工艺参数的单因素实验和多因素正交实验确定超滤浓缩蝙蝠蛾拟青霉发酵液中胞外多糖的最佳工艺参数。研究结果表明：在操作压力0.3MPa，操作温度40℃，料液pH值为6的条件下，用规格为50kD的超滤膜超滤经离心除菌的发酵液为最佳条件。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:蝙蝠蛾拟青霉；胞外多糖；超滤浓缩
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 样品制备 2
1.2.2 发酵液的超滤3
1.2.3 最佳超滤条件的确定 3
1.2.4 超滤膜的清洗 3
2 结果与分析 4
2.1 超滤条件确定 4
2.2 最佳超滤工艺参数的选择 5
2.3 膜的清洗 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的膜分离工艺研究
引言
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis （Berk．） G．H．Sung，J．M．Sung，Hywel—Jones＆Spatafora），是线虫草科(Ophiocordycipitaeeae)、线虫草属(Ophiocordyceps)的虫生真菌，寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫体上，由虫形菌核(僵虫)和子座 (草部)组成[1]。由于冬具有多种的药理活性，如抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化和提高免疫力等，一直被视为珍贵的中药材而得到广泛的应用。但鉴于天然冬虫夏草对生长 环境要求高，生长率低，加之人们对其需求的日益增加，使得野生的冬虫夏草资源紧缺，其价格甚至比黄金还高。因此，以发酵等方法探索对冬虫夏草进一步开发利用的新途径成为了研究的热点。现代研究表明，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与天然虫草化学组成较为相似，从人体必需的无机元素和微量元素与氨基酸两方面来看，二者差异不大，同时亦含有虫草素和对人体有益的腺甙类、麦角甾醇、甘露醇、多糖类 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
等[2]。蝙蝠蛾拟青霉发酵液含有多种功能性有效成分，如对病菌有抑制作用的虫草菌素、有抗癌作用的虫草多糖和对人体有益的腺苷类、麦角淄醇类、多肽类、D-甘露醇、多糖、有机酸、多胺、磷脂酰胆碱、多种微量元素及维生素、氨基酸、糖、醇类、核苷类及钾、钙等化学成分。目前已从天然虫草及其培养的真菌或发酵液中分离到多种多糖类化合物。现代研究表明，虫草多糖具有多种药理功能：提高机体的免疫功能、保护肝脏、抗辐射、延缓衰老、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、降血脂等。
膜分离技术(membrane separation technique)是一项高效的新分离技术，已被国际公认为20世纪末到21世纪中期最有发展前途的高新生产技术之一。与传统的分离方法相比，膜分离技术具有其独特的优点。膜分离过程没有相变、节能、高效、无二次污染和操作过程比较简单，经济性好，可直接放大，可专一配膜。膜分离技术已广泛应用于中药、食品工业、饮料工业、食品添加剂、植物提取、环保等、生物医药、精细化工、医药化工各个领域[3]。
本试验利用超滤膜分离技术，对蝙蝠蛾拟青霉液态发酵液的多糖进行提取分离，探究蝙蝠蛾拟青霉膜分离技术的优化工艺，为以后冬虫夏草多糖的工业化生产提供理论依据和奠定基础[4]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株
蝙蝠蛾拟青霉菌
1．1．2 培养基配方
斜面培养基成分（g/L）：
发酵培养基成分（g/L）：蔗糖50，酵母浸膏3，(NH4)2SO4 7，MgSO4 0.5，KH2PO4 1.5，麦芽粉 1[5-8]。
1．1．3 仪器
超滤设备（Mini Pellicon，密理博中国有限公司）
数显恒温水浴锅（HH-4型，常州国华电器有限公司）；
台式离心机（TDL-5型，上海安亭科学仪器厂）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A型，上海一恒科技有限公司）；
电子天平（AY-120型、BL-220H型，SHIMADZU）；
722S型可见分光光度计（722S型，上海菁华科技仪器有限公司）；
循环水式真空泵（SHB-Ⅲ型，郑州长城科工贸有限公司）；
pH计（DELTA 320，上海）。
旋涡混匀器（HYQ-2121A型，苏州捷美电子有限公司）；
1．2 实验方法
1．2．1 样品制备
选用斜面培养基配方，将培养基装入试管，放入高压灭菌锅，在121.9℃下，灭菌20min。灭菌结束后趁热摆成斜面。
在超净台上将冷冻保藏的菌种，通过无菌操作接种到斜面培养基中。17℃，无光培养，斜面上菌丝洁白茂密并无杂菌时待用。
将活化培养基上的菌种及时接入液体发酵培养基中，17℃，无光培养168h。
将发酵产物通过抽滤和离心，使菌丝与发酵液分离开来。
1．2．2 发酵液的超滤
1．2．2．1 发酵液的超滤过程
图1超滤流程图
Graph1 Ultrafiltration flow chart
如图1-1所示，把发酵液倒入料液罐中，通过进料泵将料液泵入超滤器，进入超滤膜 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
，截留液流入料液罐中，滤过液流入滤液罐中。通过调节回流阀和料液流速来控制操作压力。
1．2．2．2 膜通量的测定
一定操作压力下，溶液通过超滤膜的透过液为一定体积（V）时所需要的时间（t），用单位时间内通过单位面积（S）的透过量表示：
J=V/(S×t)
式中：J——[L/(m2?h)]；V——透过液体体积，L；S——膜的有效面积，m2；
T——超滤时间，h；
1．2．3 最佳超滤条件的确定
1．2．3．1 超滤膜的选择
在15℃的温度下，分别用两种不同孔径的超滤膜（规格分别为0.1μm和50kD）对发酵液进行超滤，对超滤后的截留液用硫酸苯酚法测总糖含量，来确定最佳超滤膜。
硫酸苯酚法测总糖含量
制作葡萄糖标准曲线。在6支试管中，分别加入配好的0.1mg/ml葡萄糖标准溶液0.0 ml、0.2ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，用纯水将各管液面补到1.0 ml。各管加6%苯酚溶液0.5 ml，再加浓硫酸2.5 ml，混匀并冷却，20 min后于分光光度计490 nm处测吸光值。以葡萄糖微克数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线[9]。
样品中总糖含量测定。配制出适当浓度的待测样品多糖溶液，用移液管取0.1 ml多糖溶液，加0.9 ml纯水，再加0.5ml 6%苯酚溶液、2.5 ml浓硫酸，混匀并冷却，过20 min后测其在490 nm波长的吸光值。
图7 各因素交互作用对膜通量影响的曲面图和等高线
[4] 胡亚芹, 曹杨. 超滤膜技术在多糖提取方面的应用[J]. 生物技术通讯, 2005, 3: 228-230.
[5] 刘欣, 张宗豪, 徐海峰,等. 冬虫夏草茵液体发酵培养基的优化研究[J]. 食用菌, 2013, (1): 14-16
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