fabp心肌型脂肪酸结合蛋白作为急性心肌梗塞早期诊断试剂盒研制
摘要： 目的 应用胶体金免疫层析法制备检测血清、血浆和全血中心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的检测试纸条，用于急性心肌梗塞（AMI）的早期辅助诊断。 方法 将抗H-FABP单克隆抗体1和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别包被于硝酸纤维素膜的检测线（Test Line）和质控线(Control Line)，用胶体金标记抗H-FABP单克隆抗体2，喷于玻璃纤维膜上制成胶体金结合物垫，组装成试纸条进行灵敏性、特异性、精密性、稳定性及临床样品检测。 结果 该检测卡的检测灵敏度为1ng/ml，15min判定结果,诊断参考值为10ng/ml。 结论 制备的H-FABP检测试纸条有良好的灵敏性、特异性，可用于早期AMI的辅助诊断。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1.1 试剂、活性材料和耗材 2
1.1.1.1 试剂 2
1.1.1.2 活性材料 2
1.1.1.3 耗材 3
1.1.2 主要仪器设备3
1.2 实验方法3
1.2.1 胶体金最佳标记pH和最佳标记蛋白量的确定3
1.2.1.1 胶体金最佳标记pH 的确定 3
1.2.1.2 胶体金最佳标记蛋白量的确定 4
1.2.2 胶体金标记物的制备 4
1.2.3 硝酸纤维素膜的包被4
1.2.3.1 包被缓冲液的确定4
1.2.3.2 抗体包被量的确定4
1.2.4 样品垫处理4 1.2.5 HFABP快速检测试纸条的组装4
1.2.6 HFABP校准品制备5
1.2.7 制作半定量比色卡5 1.2.8 HFABP检测试纸条性能验证5
1.2.8.1 特异性5
1.2.8.2 灵敏度5
1.2.8.3 线性范围5
1.2.8.4 稳定性5
1.2.8.5 精密性5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
1.2.9 临床样本检测5
1.2.9.1 体检样本检测确定参考值5
1.2.9.2 AMI样本检测5
2 结果分析5
2.1 胶体金最佳标记pH和最佳标记蛋白量的确定5
2.1.1 胶体金最佳标记pH的确定5
2.1.2 最佳标记蛋白量的确定6
2.2 HFABP快速检测试纸条的组装6
2.3 硝酸纤维素膜的包被 7
2.3.1 包被缓冲液的确定 7
2.3.2 蛋白包被量的确定7 2.4 制作半定量比色卡 7
2.5 HFABP检测试纸条性能验证 7
2.5.1 特异性7
2.5.2 灵敏度8
2.5.3 线性范围8
2.5.4 稳定性9
2.5.5 精密性10
2.6 临床样本检测 10
2.6.1 体检样本检测确定参考值10
2.6.2 AMI样本检测结果 11
3 讨论11
3.1 胶体金免疫层析快速诊断试纸条的展望 11
3.2 半定量、定量检测 11
3.3 试剂盒的使用注意事项 11
致谢12
参考文献12
图 12
图 24
图 36
图 46
图 57
图 68
图 78
图 89
图 99
表 17
表 210
表 310
表 411
表 511
FABP心肌型脂肪酸结合蛋白作为急性心肌梗塞早期诊断试剂盒研制
引言
引言
急性心肌梗死( Acute Myocardial Infarction, AMI)是冠状动脉急性闭塞，冠状动脉血流中断，心肌细胞处于长时间持续缺血缺氧状态，从而导致的局部心肌急性坏死。急性心肌梗死起病急，病程危险，预后极差，其发病率和死亡率在世界范围内居高不下，严重威胁着人类的健康与生命[1]。
世界卫生组织推荐的心肌损伤生化标志物诊断标准包括三个方面：病史与症状、心电图表现和生化标志物[2]。国际临床化学联合会(International federation of clinical chemistry, IFCC)的心肌损伤标志物标准化委员会指出：心肌损伤理想的标志物(MI Marker)应是：①在心肌中以高浓度出现，在其他组织中不出现，或在病理情况下只以微量出现；②在心肌损伤后迅速释放；③其释放量与心肌损伤的范围直接呈比例；④在血浆中可持续几个小时，以提供常规诊断的时间窗口[3]。
心肌型脂肪酸结合蛋白(HeartFatty Acid Binding Protein, HFABP)是一种新型的心肌损伤标志物。HFABP是一种可溶性细胞质蛋白，由132个氨基酸组成，分子量为15KD，特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4~8%。正常人的血浆和尿中不含有HFABP，或含量甚少[4,5]。近年来研究发现，心肌型脂肪酸结合蛋白在AMI发生1.5h后出现在血浆中，6h达到高峰，随后逐渐下降，到24h后恢复到正常水平[6]。而且，HFABP 对早期 AMI的诊断敏感性显著高于cTnI( 肌钙蛋白I) 和CKMB(肌酸激酶同工酶) ，其诊断发病3h 内的 HFABP亦明显优于cTnI、CKMB和MYO（肌红蛋白），表明 HFABP可作为早期急性心肌梗死更适宜的检测指标[69]。
研究制备HFABP检测试剂盒，为急性心肌梗塞的诊断提供一种快速简便的方法，有良好的临床应用价值。
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术[10]。免疫胶体金技术更快速、简便，并且灵敏度高，更有利于临床上对HFABP进行早期检测，可以实现POCT（即时检验，pointofcare testing）检测，让真正需要治疗的AMI病人及时得到治疗，缩短病人的就医时间，另一方面更可以缩减社会的医疗成本，让那些无需进一步治疗的病人减少支出，释放社会不必要的医疗占用，使医院能救治更多的病人。而且中国的POCT市场现在还是尚未被满足需求的巨大蓝海市场，国内企业的进口替代才刚刚开始。
本课题是在胶体金平台上，应用双抗体夹心方法开发半定量检测HFABP的试剂盒。反应原理如下：
该检测试剂应用胶体金免疫层析技术建立的检测体系，采用双抗体夹心法检测人血液样本中的HFABP含量。待检样本加至加样端后，样本通过毛细作用向上扩散，通过结合物垫时样本中的HFABP抗原与金标记HFABP抗体结合为金标抗体抗原的复合物；继续扩散至到硝酸纤维素膜上，被包被有HFABP抗体的区域（检测线）拦截，形成胶体金标抗体抗原包被抗体的免疫复合物，这时在检测区产生清楚的信号——一条红线，样本中HFABP含量越高，检测线的显色程度越深；金标记物继续沿着膜前移，当移至质控线区域时，质控线显色。如下图1：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1.1 试剂、活性材料和耗材 2
1.1.1.1 试剂 2
1.1.1.2 活性材料 2
1.1.1.3 耗材 3
1.1.2 主要仪器设备3
1.2 实验方法3
1.2.1 胶体金最佳标记pH和最佳标记蛋白量的确定3
1.2.1.1 胶体金最佳标记pH 的确定 3
1.2.1.2 胶体金最佳标记蛋白量的确定 4
1.2.2 胶体金标记物的制备 4
1.2.3 硝酸纤维素膜的包被4
1.2.3.1 包被缓冲液的确定4
1.2.3.2 抗体包被量的确定4
1.2.4 样品垫处理4 1.2.5 HFABP快速检测试纸条的组装4
1.2.6 HFABP校准品制备5
1.2.7 制作半定量比色卡5 1.2.8 HFABP检测试纸条性能验证5
1.2.8.1 特异性5
1.2.8.2 灵敏度5
1.2.8.3 线性范围5
1.2.8.4 稳定性5
1.2.8.5 精密性5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
1.2.9 临床样本检测5
1.2.9.1 体检样本检测确定参考值5
1.2.9.2 AMI样本检测5
2 结果分析5
2.1 胶体金最佳标记pH和最佳标记蛋白量的确定5
2.1.1 胶体金最佳标记pH的确定5
2.1.2 最佳标记蛋白量的确定6
2.2 HFABP快速检测试纸条的组装6
2.3 硝酸纤维素膜的包被 7
2.3.1 包被缓冲液的确定 7
2.3.2 蛋白包被量的确定7 2.4 制作半定量比色卡 7
2.5 HFABP检测试纸条性能验证 7
2.5.1 特异性7
2.5.2 灵敏度8
2.5.3 线性范围8
2.5.4 稳定性9
2.5.5 精密性10
2.6 临床样本检测 10
2.6.1 体检样本检测确定参考值10
2.6.2 AMI样本检测结果 11
3 讨论11
3.1 胶体金免疫层析快速诊断试纸条的展望 11
3.2 半定量、定量检测 11
3.3 试剂盒的使用注意事项 11
致谢12
参考文献12
图 12
图 24
图 36
图 46
图 57
图 68
图 78
图 89
图 99
表 17
表 210
表 310
表 411
表 511
FABP心肌型脂肪酸结合蛋白作为急性心肌梗塞早期诊断试剂盒研制
引言
引言
急性心肌梗死( Acute Myocardial Infarction, AMI)是冠状动脉急性闭塞，冠状动脉血流中断，心肌细胞处于长时间持续缺血缺氧状态，从而导致的局部心肌急性坏死。急性心肌梗死起病急，病程危险，预后极差，其发病率和死亡率在世界范围内居高不下，严重威胁着人类的健康与生命[1]。
世界卫生组织推荐的心肌损伤生化标志物诊断标准包括三个方面：病史与症状、心电图表现和生化标志物[2]。国际临床化学联合会(International federation of clinical chemistry, IFCC)的心肌损伤标志物标准化委员会指出：心肌损伤理想的标志物(MI Marker)应是：①在心肌中以高浓度出现，在其他组织中不出现，或在病理情况下只以微量出现；②在心肌损伤后迅速释放；③其释放量与心肌损伤的范围直接呈比例；④在血浆中可持续几个小时，以提供常规诊断的时间窗口[3]。
心肌型脂肪酸结合蛋白(HeartFatty Acid Binding Protein, HFABP)是一种新型的心肌损伤标志物。HFABP是一种可溶性细胞质蛋白，由132个氨基酸组成，分子量为15KD，特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4~8%。正常人的血浆和尿中不含有HFABP，或含量甚少[4,5]。近年来研究发现，心肌型脂肪酸结合蛋白在AMI发生1.5h后出现在血浆中，6h达到高峰，随后逐渐下降，到24h后恢复到正常水平[6]。而且，HFABP 对早期 AMI的诊断敏感性显著高于cTnI( 肌钙蛋白I) 和CKMB(肌酸激酶同工酶) ，其诊断发病3h 内的 HFABP亦明显优于cTnI、CKMB和MYO（肌红蛋白），表明 HFABP可作为早期急性心肌梗死更适宜的检测指标[69]。
研究制备HFABP检测试剂盒，为急性心肌梗塞的诊断提供一种快速简便的方法，有良好的临床应用价值。
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术[10]。免疫胶体金技术更快速、简便，并且灵敏度高，更有利于临床上对HFABP进行早期检测，可以实现POCT（即时检验，pointofcare testing）检测，让真正需要治疗的AMI病人及时得到治疗，缩短病人的就医时间，另一方面更可以缩减社会的医疗成本，让那些无需进一步治疗的病人减少支出，释放社会不必要的医疗占用，使医院能救治更多的病人。而且中国的POCT市场现在还是尚未被满足需求的巨大蓝海市场，国内企业的进口替代才刚刚开始。
本课题是在胶体金平台上，应用双抗体夹心方法开发半定量检测HFABP的试剂盒。反应原理如下：
该检测试剂应用胶体金免疫层析技术建立的检测体系，采用双抗体夹心法检测人血液样本中的HFABP含量。待检样本加至加样端后，样本通过毛细作用向上扩散，通过结合物垫时样本中的HFABP抗原与金标记HFABP抗体结合为金标抗体抗原的复合物；继续扩散至到硝酸纤维素膜上，被包被有HFABP抗体的区域（检测线）拦截，形成胶体金标抗体抗原包被抗体的免疫复合物，这时在检测区产生清楚的信号——一条红线，样本中HFABP含量越高，检测线的显色程度越深；金标记物继续沿着膜前移，当移至质控线区域时，质控线显色。如下图1：
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